基于DMP阳离子纳米粒递送siRNA体外抗小鼠结肠癌活性及姜黄素纳米粒的研究

发布时间：2020-04-01 00:19

【摘要】：目前,肿瘤的治疗是世界医学研究的重点,而抗肿瘤药物及其递送系统的研究则是肿瘤治疗的关键。在对抗肿瘤中药有效成分与传统药物的研究中,由于其稳定性差、代谢过快、体内生物利用度低而限制了它们的应用,而对于基因药物来说,同样它们存在体内不稳定,易被核酸酶降解,细胞摄取率低等问题使临床应用受到限制。因此,建立和寻求合适的载药系统成为了发展抗肿瘤中药有效成分、传统药物和基因药物实现安全有效的肿瘤治疗共同的需求。在前期的研究中,结合(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)和甲氧基聚乙二醇-聚己内酯MPEG-PCL制备了混合型纳米粒(DMP)。然而,DMP作为基因载体仅限于质粒DNA的递送,DMP用于siRNA的递送从未被报道过。在本文中,通过优化DMP的制备工艺,制备得到适于递送siRNA的DMP,并用DMP递送MCL1 siRNA(DMP/siMCL1)和Bcl-xl siRNA(DMP/siBcl-xl)至C26细胞中对其体外抗小鼠结肠癌活性进行研究。姜黄素具有显著的抗肿瘤活性,但由于其稳定性差、难溶于水、体内生物利用度低而限制了姜黄素在体内的抗肿瘤作用。因此,本研究用聚合物纳米粒MPEG-PCL包裹姜黄素制备成姜黄素纳米粒,改善姜黄素的水溶性并提高其作用效果。首先对制备的阳离子纳米粒DMP的相关参数指标来对其理化性能特征进行评价:粒径分布、电位大小、复合siRNA能力、细胞毒性高低以及血清条件下的稳定性和递送能力。通过对DMP的制备工艺进行筛选得到最佳制备工艺,制备所得的纳米粒具有46.4nm的平均粒径和44.1mV的zeta电位,带正电荷,均匀分散在水溶液中,多分散系数PDI为0.215。通过凝胶阻滞实验证明DMP具有负载siRNA的能力。细胞毒性实验表明,与PEI25K相比,DMP具有较低的细胞毒性。在体外血清转染实验中DMP显示低细胞毒性和高转染效率,有血清转染组与无血清转染组的转染效率差别不大,DMP的转染效率不受血清浓度的影响。其次,本实验使用MCL1 siRNA和Bcl-xl siRNA作为治疗靶点,研究它们体外抗小鼠结肠癌活性。在体外基因沉默表达检测实验中,用MCL1 siRNA和Bcl-xl siRNA对C26细胞进行处理,通过荧光定量PCR法对其相应表达的mRNA的含量进行测定,结果表明与空白对照组相比,经过MCL1siRNA和Bcl-xl siRNA转染的实验组,C26细胞表达的mRNA含量水平明显减少。在体外抗肿瘤活性的研究中,通过MTT实验和克隆形成实验来对细胞增殖能力进行考察。MTT实验结果表示,DMP/siMCL1与DMP/siBcl-xl的细胞生存率均低于对应相同浓度的DMP组,表明DMP/siMCL1与DMP/siBcl-xl能抑制C26细胞的生长和增殖能力。在平板克隆形成实验中,DMP/siMCL1和DMP/siBcl-xl具有较高的克隆形成抑制率,对C26细胞的生长和增殖显示出较强的抑制作用。在凋亡实验中,我们用流式法对体外抗肿瘤细胞凋亡进行定量的测定,DMP/siMCL1与DMP/siBclxl的细胞凋亡率明显的高于相应的对照组与其他实验组,具有诱导细胞凋亡的作用。Western Blot实验表明,相对于control、DMP以及DMP/Scramble siRNA组,DMP/siBcl-xl组明显的降低了Bcl-xl的蛋白水平的表达,且高浓度的DMP/siBclxl组作用更加明显。姜黄素具有显著的抗肿瘤活性,但由于其稳定性差、代谢过快、体内生物利用度低而限制了姜黄素在体内的抗肿瘤作用。为了实现以DMP纳米粒为基础的中药有效成分与基因药物的联合使用增强抗肿瘤的治疗效果,我们使用MP纳米粒包裹姜黄素改善其水溶性。所制备的姜黄素纳米粒的平均粒径38.65nm,呈电中性,多分散系数PDI为0.386,可均匀分散在水溶液中,平均包封率达92.8%,平均载药量为1.5%。本课题中,DMP具有传输不同siRNA的能力,能安全高效地将MCL1 siRNA以及Bcl-xl siRNA分别递送至C26细胞中。DMP/siMCL1和DMP/siBcl-xl具有体外抗小鼠结肠癌活性,能够抑制小鼠结肠癌细胞的生长与增殖。姜黄素纳米粒具有良好的理化性能与体外抗小鼠结肠癌活性。基于DMP,通过评价其递送基因药物siRNA与中药有效成分姜黄素的相关活性,为DMP装载姜黄素制备的纳米粒与siRNA进行协同治疗以增强抗肿瘤治疗效果奠定基础。
【图文】：

粒径分布,纳米粒,粒径分布,成都中医药大学

成都中医药大学 2018 届硕士学位论文制备所得的阳离子纳米粒 DMP 外观均匀，无沉淀，平均粒径为 46.4nm，可完全分散在水溶液中，多分散系数 PDI 为 0.215，zeta 电位为 44.1mV。粒径和zeta 电位结果如图 3, 4 所示

纳米粒,阳离子

11图 4 DMP 纳米粒的 zeta 电位Fig 4 Zeta potential of DMP nanoparticles1.3.2.2 阳离子纳米粒 DMP 的稳定性试验结果将制备好的阳离子纳米粒 DMP 存放于 4℃中，分别在 24 小时，48 小时，96 小时后观察 DMP 的状态，结果表明 DMP 在 4℃条件下存放 96 小时后仍然呈透明状，，外观均匀，无沉淀，表明 DMP 具有较高的稳定性。
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285

【相似文献】