基于TOLL样受体4研究当归芍药散对老年痴呆小鼠的作用机制

发布时间：2020-04-01 21:24

【摘要】：阿尔兹海默症(Alzheimer's disease,AD)是一种神经系统退行性疾病,表现为认知损伤和渐进性记忆障碍,其主要的病理特征是胞外β淀粉样蛋白(pamyloidβ,Aβ)沉积形成老年斑和胞内tau蛋白超磷酸化形成神经纤维缠结以及脑皮层神经细胞数量的减少。AD发病的病理机制非常复杂,与多种信号通路和因素有关,如Aβ、tau蛋白、神经元损伤、慢性炎症等。在众多发病机制中,阿尔兹海默症的发生和发展与脑内小胶质细胞介导的慢性神经炎症有重要联系,从而受到广泛的关注和研究。研究目的:课题组前期研究表明,当归芍药散(Danggui-Shaoyao-San,DSS)能明显改善D-半乳糖联合AlCl_3引起所致的痴呆小鼠海马区皮质、神经元细胞、神经胶质细胞的损伤,在改善神经元细胞之间的连接、神经元细胞结构、改善多种细胞器功能以及增加突触数量等方面,都有一定的作用。但目前少见其在神经炎症方面的作用进行详细的研究,本研究通过DSS对Aβ诱导小胶质细胞神经炎症反应及对其介导的炎症通路TLR4/NF-κB信号通路的影响,以揭示DSS是否通过该通路影响AD的机制。研究方法:本研究通过(1)对C57BL/10JNju小鼠脑定位注射Aβ_(1-42)建立老年痴呆模型,连续4周灌胃给予DSS(2g(生药)/mL)。(2)通过测定Morris水迷宫定位航行实验和空间探索实验来检测DSS对Aβ_(1-42)诱导AD小鼠学习记忆能力的影响;(3)采用HE染色及尼氏染色法观察脑组织病理学变化来检测小鼠脑组织形态的改变;采用免疫组化法观察脑组织CD11b的表达来反映小胶质细胞激活的程度;(4)RT-PCR检测神经炎症相关蛋白mRNA的表达;(5)Western blot检测TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白的表达。随后采用TLR4基因敲除C57BL/10ScNJNju小鼠同样给予Aβ_(1-42)注射建立AD小鼠模型,给予DSS灌胃后,采用相同的实验方法来探讨DSS与TLR4/NF-κB信号通路的关系。实验结果:第一部分当归芍药散对老年痴呆模型小鼠实验研究结果显示:DSS能够改善Aβ_(1-42)建立AD小鼠的学习记忆能力,水迷宫的逃避潜伏期明显缩短;病理组织学结果显示DSS能够改善AD小鼠脑组织形态的改变,增强细胞活力。免疫组化显示DSS能减少小胶质细胞的激活。进一步研究表明DSS能降低AD鼠脑组织中TLR4mRNA的表达,增加IκBmRNA的表达。可以降低脑组织中TLR4、p-P65蛋白的表达,提高IκB蛋白的表达,降低AD小鼠脑中P65蛋白磷酸化水平。结果提示,DSS可以提高AD小鼠的学习记忆能力,减少脑中的炎症反应,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活有关。实验二当归芍药散对TLR4缺失老年痴呆模型小鼠实验研究结果显示:研究对TLR4基因敲除的小鼠进行Aβ_(1-42)注射后,小鼠学习记忆能力受到影响,水迷宫的潜伏期明显增加,给予DSS后水迷宫潜伏期缩短。病理组织学结果显示模型组脑中锥体细胞排列松散,给予DSS后,锥体细胞排列稍紧密。免疫组化显示DSS能刺激TLR4缺失AD小鼠脑中小胶质细胞的激活。模型组小鼠脑中IκB蛋白的表达上调,p-P65、p-JNK蛋白的表达下调,而给予DSS后IκB蛋白的表达下调,p-P65、p-JNK蛋白的表达上调。提示TLR4蛋白的缺失导致Aβ_(1-42)无法激活TLR4/NF-κB信号通路,从而导致小鼠脑中P-65、p-JNK蛋白磷酸化水平的下降。基于小胶质细胞的双重作用,缺失TLR4的情况下,结合水迷宫实验结果,DSS有可能通过其他旁路激活脑部的小胶质细胞来吞噬Aβ_(1-42)并减轻其带来的脑部炎症损伤。
【图文】：

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广东药科大学硕士研究生学位论文（0.08mL/10g），等待小鼠麻醉后，将其安稳固定在脑定位仪上发，用碘酊消毒后做 0.8cm 左右的纵向切口。结合 George 图谱前卤后 2.2mm，中线左右各旁开 2.0mm，用颅钻钻开颅骨，小膜，用 10μL 微量注射器自脑表面进针 2.2mm，每侧脑用时 51-42溶液，注射后留针 5min，之后用 1min 缓慢撤针（注射位置为 CA1 区），，正常对照组注射等量的灭菌生理盐水，伤口消毒后进

Morris水迷宫,小鼠,药科大学,所需时间

广东药科大学硕士研究生学位论文表 2.1 各组小鼠 MWM 逃避潜伏期（ x±s，n=8）别 Day1 Day2 Day3 Day4 Day5BK90.0±0.085.3±13.3 76.4±23.5 68.2±29.0 34.6±29.BM90.0±0.090.0±0.0 90.0±0.0*83.8±13.0**54.3±27.BG90.0±0.082.8±10.6 72.0±25.0#51.4±21.4##21.4±14.注：与正常组比较*P<0.05,**P<0.01；与模型组比#P<0.05,##P<0.01
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】