【摘要】：目的:通过运用细胞培养技术、动物实验技术以及病理学、免疫学、分子生物学等实验技术,研究麻杏石甘汤对A型流感病毒介导的IL-6、MCP-1表达水平的影响,探讨麻杏石甘汤对A型流感病毒免疫调节机制。方法:1.MTT法检测麻杏石甘汤含药血清对A型流感病毒感染的RAW264.7细胞活性的影响;用ELISA法检测RAW264.7细胞上清中IL-6、MCP-1含量水平。2.建立动物模型,经灌胃给药或生理盐水3天和7天后,处死小鼠,取小鼠肺组织、脾组织、胸腺组织和结肠组织。检测各组小鼠体重、体重下降率、肺指数、肺指数抑制率、脾指数和胸腺指数;用HE染色观察小鼠肺组织和结肠组织病理变化;用ELISA法检测小鼠血清中IL-6、MCP-1含量水平;用免疫组织化学的方法检测小鼠肺组织、结肠组织中IL-6、MCP-1蛋白表达水平;用western blotting技术检测肺组织中IL-6、MCP-1蛋白表达水平。结果:1.与10%浓度胎牛血清正常细胞对照组比较,浓度为50%、25%、12.5%、6.25%的大鼠空白血清作用24h、48h对应的细胞活性OD值均显著升高(p0.01),表明大鼠空白血清对RAW264.7细胞没有毒性作用,RAW264.7细胞仍能继续生长。与大鼠空白血清组比较,浓度为50%、25%、12.5%、6.25%的各大鼠含药血清作用24h、48h对应的细胞活性OD值无明显差异(p0.05),表明各大鼠含药血清对RAW264.7细胞没有毒性作用。考虑到常规细胞培养胎牛血清的浓度为10%,故本实验选择浓度为12.5%的大鼠含药血清为后续实验中加样检测相关指标。2.与正常对照组比较,病毒对照组在流感病毒作用24h与48h的RAW264.7细胞上清中IL-6、MCP-1含量水平显著升高(p0.01);与病毒对照组比较,给药治疗24h、48h的麻杏石甘汤组IL-6含量水平明显下降(p0.05)。3.麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠体重、各脏器指数及肺脏病理变化的影响:(1)麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠体重的影响:与正常对照组比较,流感病毒感染小鼠后,模型对照组体重显著降低(p0.01)。与模型对照组比较,各药物治疗组小鼠体重显著升高(p0.01),给药治疗3天的麻杏石甘汤组体重下降抑制率为23.39%;给药治疗7天的麻杏石甘汤组体重下降抑制率为26.68%。(2)麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠肺指数、肺指数抑制率的影响:与正常对照组比较,流感病毒感染小鼠后,模型对照组肺指数显著升高(p0.01)。与模型对照组比较,各药物治疗组小鼠肺指数显著下降(p0.01),给药治疗3天的麻杏石甘汤组肺指数抑制率为28.67%;给药治疗7天的麻杏石甘汤组肺指数抑制率为29.47%。(3)麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠脾指数、胸腺指数的影响:与正常对照组比较,流感病毒感染小鼠后,模型对照组脾指数、胸腺指数显著下降(p0.01)。与模型对照组比较,给药治疗3天和给药治疗7天的麻杏石甘汤组小鼠脾指数、胸腺指数显著升高(p0.01)。(4)麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠肺脏病理变化的影响:正常对照组小鼠肺泡大小正常,肺泡囊、肺泡管、肺泡隔、细支气管等组织结构正常,无炎性细胞浸润;模型对照组小鼠肺泡大小不一致,肺泡囊、肺泡管、肺泡隔、细支气管等正常结构遭到破坏,有大量的炎细胞浸润,肺部血管内充血;经药物干预后,麻杏石甘汤组小鼠肺组织炎症有明显减轻。4.麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠结肠病理变化的影响:正常对照组结肠粘膜上皮完整,腺体排列规则;间质内无充血、水肿、炎细胞浸润;流感病毒进攻机体后,结肠黏膜上皮水肿、甚至脱落,腺体排列不规则,黏膜腺体破坏,黏膜内充血、水肿,有大量炎细胞浸润。经药物干预后,麻杏石甘汤组小鼠结肠组织炎症有不同程度的减轻。5.麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠血清中IL-6、MCP-1含量水平的影响:与正常对照组比较,模型对照组小鼠血清中IL-6含量水平显著上升(p0.01);与模型对照组比较,给药治疗3天和给药治疗7天的麻杏石甘汤组IL-6含量水平不同程度下降,有明显差异(p0.01或p0.05);给药治疗3天的麻杏石甘汤组IL-6含量水平明显降低(p0.05)。给药治疗7天的麻杏石甘汤组IL-6含量水平显著降低(p0.01)。与正常对照组比较,模型对照组小鼠血清中MCP-1含量水平显著升高(p0.01);与模型对照组相比,给药治疗3天和给药治疗7天的麻杏石甘汤组MCP-1含量水平明显下降(p0.05)。6.麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠肺组织中IL-6、MCP-1蛋白表达水平的影响:(1)免疫组化法检测结果:与正常对照组比较,模型对照组小鼠肺组织中IL-6蛋白表达水平显著上升(p0.01);与模型对照组比较,给药治疗3天和给药治疗7天的麻杏石甘汤组IL-6蛋白表达水平明显下降(p0.05)。与正常对照组比较,流感病毒感染小鼠后,模型对照组小鼠肺组织中MCP-1蛋白表达水平显著升高(p0.01);与模型对照组比较,给药治疗3天和给药治疗7天的麻杏石甘汤组MCP-1蛋白表达水平不同程度降低,有明显差异(p0.01或p0.05);给药治疗3天的麻杏石甘汤组MCP-1蛋白表达水平明显下降(p0.05)。给药治疗7天的麻杏石甘汤组MCP-1含量水平显著降低(p0.01)。(2)Western blotting法检测结果:与正常对照组比较,模型对照组小鼠肺组织中IL-6蛋白表达水平显著升高(p0.01);与模型对照组比较,给药治疗3天和给药治疗7天的麻杏石甘汤组IL-6蛋白表达水平不同程度降低,有明显差异(p0.01或p0.05);给药治疗3天的麻杏石甘汤组IL-6蛋白表达水平显著下降(p0.01)。给药治疗7天的麻杏石甘汤组IL-6含量水平明显降低(p0.05)。与正常对照组比较,模型对照组小鼠肺组织中MCP-1蛋白表达水平显著升高(p0.01);与模型对照组比较,给药治疗3天和给药治疗7天的麻杏石甘汤组MCP-1蛋白表达水平显著降低(p0.01)。7.麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠结肠组织中IL-6、MCP-1蛋白表达水平的影响:与正常对照组相比,模型对照组小鼠结肠组织中IL-6、MCP-1蛋白表达水平不同程度升高,有明显差异(p0.01或p0.05);与模型对照组比较,给药治疗3天和给药治疗7天的麻杏石甘汤组小鼠结肠组织中IL-6、MCP-1蛋白表达水平无明显差异(p0.05)。8.流感病毒感染小鼠肺指数与肺组织IL-6、MCP-1蛋白表达水平相关性分析检测:给药治疗3天和给药治疗7天的肺指数与肺组织IL-6蛋白表达水平之间,以及肺指数与肺组织MCP-1蛋白表达水平之间具有相关性。9.肺组织与结肠组织IL-6和MCP-1蛋白表达水平相关性分析检测:给药治疗3天的肺组织与结肠组织IL-6蛋白表达水平之间以及肺组织与结肠组织MCP-1蛋白表达水平之间具有相关性。结论:1.流感病毒攻击RAW264.7细胞后,病毒能感染并吸附细胞,为研究流感病毒体外实验建立良好的模型;流感病毒感染RAW264.7细胞后,细胞上清中IL-6、MCP-1含量升高,说明流感病毒进入机体后,引起细胞因子和趋化因子的释放,而经麻杏石甘汤治疗后,IL-6、MCP-1含量降低,表明麻杏石甘汤能抑制炎症反应,调节免疫功能。2.流感病毒感染小鼠后体重下降,肺部严重充血,肺指数升高,说明小鼠肺部感染模型造模成功,经麻杏石甘汤治疗后,小鼠体重上升;流感病毒感染小鼠后肺指数上升,小鼠肺部有明显炎症反应,流感病毒感染小鼠后脾指数、胸腺指数下降,说明小鼠免疫器官遭受病理损伤,机体免疫功能下降;经麻杏石甘汤治疗后,小鼠肺指数下降,表明麻杏石甘汤能减轻炎症反应;经麻杏石甘汤治疗后,小鼠脾指数、胸腺指数上升,表明麻杏石甘汤对小鼠免疫器官有保护作用。3.流感病毒入侵后,小鼠肺脏正常结构遭到破坏,有大量炎细胞浸润,经药物治疗后,肺部炎症反应减轻;流感病毒入侵后,小鼠结肠粘膜充血、水肿,甚至粘膜上皮脱落,经药物治疗后,结肠炎症反应减轻。4.流感病毒入侵后,小鼠血清中IL-6、MCP-1含量升高,说明流感病毒进入机体后,引起细胞因子和趋化因子的释放,经麻杏石甘汤治疗后,IL-6、MCP-1含量降低,表明麻杏石甘汤能调节免疫答应。5.流感病毒入侵后,小鼠肺组织中IL-6、MCP-1蛋白表达水平升高,说明流感病毒进入机体后,肺组织中细胞因子和趋化因子增多,经麻杏石甘汤治疗后,IL-6、MCP-1蛋白表达水平下降,表明麻杏石甘汤能调节肺组织中细胞因子和趋化因子的蛋白表达水平,减轻肺部炎症。6.流感病毒入侵后,小鼠结肠组织中IL-6、MCP-1蛋白表达水平升高,说明流感病毒进入机体后,结肠组织中细胞因子和趋化因子增多,经麻杏石甘汤治疗后,IL-6、MCP-1蛋白表达水平无明显差异。7.肺指数与肺组织IL-6、MCP-1蛋白表达水平之间存在相关关系;肺组织与结肠组织IL-6、MCP-1蛋白表达水平之间的相关性与给药时间点相关。8.流感病毒感染后肺部的炎症有可能扩散,而引起疾病的传变,其物质基础有可能是炎性细胞因子,课题组还需进一步研究。
【图文】：
24h 与 48h 的 RAW264.7 细 胞 上 清 中 IL-6 含 量 水 平 显 著 上 升（ p＜ 0.01）； 病 毒 对 照 组 比 较 ，， 给 药 治 疗 24h、 48h 的 麻 杏 石 甘 汤 组 IL-6 含 量 水 平 显 下 降 （ p＜ 0.05） 。 5：各 组 RAW264.7 细 胞 上 清 中 IL-6（ pg/ml）含 量 水 平（x s，n＝ 5）组 别 给 药 24h 给 药 48h正 常 对 照 组 65.45± 2.95 63.76± 3.78病 毒 对 照 组80.04± 3.39**76.75± 4.55**奥 司 他 韦 组 68.42± 4.47△ △65.89± 3.31△ △麻 杏 石 甘 汤 组 74.27± 2.97△70.98± 2.38△F 值 10.425 10.622P 值 0.000 0.000 ：与 正 常 对 照 组 比 较 ，**p＜ 0.01；与 模 型 对 照 组 比 较 ，△ △ p＜ 0.01， p＜ 0.05。
各组RAW264.7细胞上清中MCP-1含量水平
【学位授予单位】：湖南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285
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