【摘要】：目的通过动物心梗模型验证辛温通阳法的代表药物葱白提取物防治心梗后室性心律失常的疗效,初步阐明葱白提取物作用机制;利用芯片筛选可逆性差异性微小RNA并结合生物信息学预测靶蛋白,进一步明确葱白提取物治疗心梗后室性心律失常的微小RNA调控机制。方法本研究选用体重为250-300克,3-4月龄的健康纯种SD雄性大白鼠,随机分为预防组和治疗组。预防组(A-L)分为:假手术组、空白模型组、葱白组、葱白提取物组和胺碘酮片组,每组15只;治疗组分为急性组(1周)和慢性组(4周),每组又分为假手术组、空白模型组、葱白组、葱白提取物组和胺碘酮片组,每组15只。行腹腔注射麻醉,上呼吸机,开胸,暴露心脏,丝线围绕左前降支结扎,直至所在范围内的心肌明显肿胀、变暗、无收缩运动,心电监护示ST段抬高0.5mV,且30min内不回落,示心肌梗死模型制备成功。预防组大鼠麻醉后连接体表心电图,造模成功后,设置刺激电极,进行程序电刺激诱发室性心律失常;治疗组分别于给药结束后,大鼠麻醉后连接体表心电图,开胸,设置刺激电极,进行程序电刺激诱发室性心律失常。预防组连续给药1w后建立心梗模型;治疗组建立心梗模型后,从术后第二天开始灌胃给药。急性组连续给药1w,慢性组连续给药4w。治疗结束后在体诱发心律失常,记录所发生的室性心律失常的种类。比较各组之间心律失常评分,进行疗效评价。采用微小RNA芯片比较预防组和治疗组共20只SD大鼠心肌细胞的miRs差异性表达,给予药物处理后恢复原来表达谱。列出可逆性差异miRs表达谱。设计相应引物,QRT-PCR进一步验证上述可逆性差异性表达的miRs。用TargetScan和PicTar工具,预测miRs靶蛋白,根据蛋白功能,建立葱白提取物-miRNA-mRNA蛋白通路,利用luciferase实验在HEK293细胞中验证miRs同靶蛋白的序列特异性,上调和/或下调相应miRs,在心肌细胞中检测其蛋白表达相关性。结果1.预防给药实验中,与空白模型组比较,葱白组大鼠VP、VT及胺碘酮片组大鼠VT、VF的发生例数无显著性差异(P0.05),其余各治疗组均可降低心梗后大鼠心律失常的发生例数(P0.01),葱白提取物组效果最为显著(P0.01)。与空白模型组比较,葱白组大鼠心律失常的发生时间、持续时间及发生率无显著性差异(P0.05),葱白提取物组和胺碘酮片组均可延长心律失常发生时间,减少持续时间和发生率(P0.01),胺碘酮片组效果最为显著(P0.01)。与空白模型组比较,葱白组大鼠ST段抬高程度及Mest评分无显著性差异(P0.05),葱白提取物组和胺碘酮片组均可降低ST段抬高程度及Mest评分(P0.05),葱白提取物组效果最为显著(P0.01)。急性给药实验中,与空白模型组比较,葱白组及胺碘酮片组VT、VF的发生例数无显著性差异(P0.05),其余各治疗组均可降低心梗后大鼠心律失常发生例数(P0.01),葱白提取物组效果最为显著(P0.01)。与空白模型组比较,葱白组大鼠心律失常的发生时间、持续时间及发生率无显著性差异(P0.05),葱白提取物组和胺碘酮片组均可延长心律失常发生时间,减少持续时间和发生率(P0.01),葱白提取物组效果最为显著(P0.01)。与空白模型组比较,葱白组大鼠心律失常的发生时间、持续时间及发生率无显著性差异(P0.05),葱白提取物组和胺碘酮片组均可延长心律失常发生时间,减少持续时间和发生率(P0.01)。慢性给药实验中,与空白模型组比较,葱白组及胺碘酮片组VP、VF的发生例数无显著性差异(P0.05),其余各治疗组均可降低心梗后大鼠心律失常发生例数(P0.01),葱白提取物组效果最为显著(P0.01)。与空白模型组比较,葱白组大鼠心律失常的发生时间、持续时间及发生率无显著性差异(P0.05),葱白提取物组和胺碘酮片组均可延长心律失常发生时间,减少持续时间和发生率(P0.01),葱白提取物组效果最为显著(P0.01)。与空白模型组比较,葱白组大鼠心律失常的发生时间、持续时间及发生率无显著性差异(P0.05),葱白提取物组和胺碘酮片组均可延长心律失常发生时间,减少持续时间和发生率(P0.01)。2.运用miRNA芯片,我们列出了10对葱白提取物处理心梗后大鼠心肌细胞和无葱白提取物处理对照组大鼠心肌细胞中的miRNAs表达谱。散点图可被用于葱白提取物处理组和无葱白提取物处理组中的miRNAs不同表达的视觉评估。图中X轴和Y轴的值代表两组样本信号经标准化后的平均值(log2缩放),绿色直线为倍数变化线。图中央的绿线代表倍数变化(Fold Change)为1倍,表示两组样本之间无差异。位于最上方绿色直线以上和最下方绿色直线以下的miRNAs,表示其在两组样本之间的倍数变化大于1.5倍。散点图用于筛选出倍数变化在1.5倍以上的一般数据。火山图可被用于显示倍数变化和统计学意义之间的关系,更为直观的显示了葱白提取物处理组和无葱白提取物处理组之间miRNAs表达的显著差异。两条垂直绿线分别表示上调或者下调1.5倍,水平绿线表示P值为0.05,红色标识表示差异在1.5倍以上,且P值小于0.05具有统计学意义的miRNAs。mi RNAs芯片筛选出葱白提取物处理组大鼠心肌细胞中可逆性恢复的67个具有显著表达差异的miRNAs(FC1.5,P0.05)。其中,分别有16个miRNAs表达上调,51个miRNAs表达下调。上调最明显的miR-21及下调最明显的miR-15b-5p作为后续验证对象。在qRT-PCR对15组样本的验证中,与未使用葱白提取物的对照组相比,葱白提取物组大鼠心肌细胞中miR-15b-5p表达均显著减少(p0.05),miR-21表达均显著增加(p0.05)。miR-15b-5p及miR-21的表达水平均与其在miRNAs芯片中的表达趋势相一致。3.基于TargetScan数据库(7.0版)找出了与心律失常相关的miR-15b-5p的靶基因WNT3A以及miR-21的靶基因TGFβR2(图3.1)。在HEK293细胞中,分别过表达miR-15b-5p及miR-21,检测它们对含靶基因3’UTR的报告基因抑制情况。其中,miR-15b-5p明显抑制含有野生型(WT)WNT3A基因的3’UTR的报告基因表达(P0.01),而对突变型(Mut)WNT3A基因的3’UTR的报告基因表达无明显差异;同样的,miR-21明显抑制含有野生型(WT)TGFβR2基因的3’UTR的报告基因表达(P0.01),而对突变型(Mut)TGFβR2基因的3’UTR的报告基因表达无明显差异。在大鼠心梗后心肌细胞中分别敲低miR-15b-5p及过表达mi R-21后,与对照组相比,miR-15b-5p敲低组靶蛋白WNT3A表达水平上升,miR-21过表达组靶蛋白TGFβR2表达水平下降。结论1.辛温通阳中药葱白提取物可通过影响大鼠模型心梗后室性心律失常的发生类型、发生及持续时间、发生率和ST段抬高程度进而改善心梗后室性心律失常的发生发展。2.葱白提取物防治急性心肌梗死后室性心律失常的微小RNA作用机制主要与调节miR-15b-5p及mi R-21的表达有关,可能通过影响Wnt/β-catenin及TGF-β/Smad信号转导通路有关,其具体的调控机制有待进一步的深入研究。
【图文】：
图2.1 miRNAs差异散点图（数据归一化；X轴：非葱白提取物对照组；Y轴：葱白提取物处理组；绿色直线代表倍数变化，miRNAs位于最上方绿色直线以上和最下方绿色直线以下的，，表示其在两组样本之间的倍数变化大于1.5倍）。2.2 QRT-PCR验证miR-21及miR-15b-5p表达水平 15对验证样本中，与未使用葱白提取物的对照组相比，葱白提取物组大鼠心肌细胞中miR-15b-5p表达均显著减少（p＜0.05，图2.3A和C），miR-21表达均显著增加（p＜0.05，图2.3B和C）。miR-15b-5p及miR-21的表达水平均与其在miRNAs芯片中的表达趋势相一致。
图2.2 miRNAs差异分布火山图（X轴：倍数变化；Y：P值；垂直绿线相当于1.5倍上调或者下调，水平绿线代表P值为0.05；图中红点代表有统计学意义的miRNAs差异表达，即FC＞1.5，P＜0.05）。
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
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本文编号：2615240
