益脉颗粒抗动脉粥样硬化的疗效机制研究

发布时间：2020-04-07 13:20

【摘要】：目的:本研究旨在通过生物信息技术、代谢组学高通量的测序技术、宏基因组技术等方法探究益脉颗粒治疗动脉粥样硬化的疗效作用机制,并寻找相关肠道菌群和代谢产物的变化,及它们之间的相关性,为益脉颗粒在临床上治疗动脉粥样硬化提供可靠的治疗依据。材料与方法:1益脉颗粒疗效机制研究:通过生物信息学技术对益脉颗粒的全部药物的潜在调控的基因进行预测。应用TCMBATMAN数据库查询益脉颗粒的饮片名称,获得各个药物的主要成分;应用DRUGBANK查询药物主要成分的作用靶点,再经过uniprot进行映射,将其转至人类基因;应用Disgenet及TCD数据库;获得AS发病的相关基因,并将基因与益脉颗粒主要成分作用靶点进行交叉比对,推测益脉颗粒治疗AS的作用靶点;应用STRING数据库构建背景网络,计算各个靶点的节点度,根据节点度对上述靶点进行排序,最终获得益脉颗粒作用于AS的潜在分子靶点,即根据益脉颗粒药物构成对药物内全部作用于AS的靶点基因进行韦恩图绘制确定重要的靶向基因。选取SPF级C57BL/6J小鼠,日龄56d,12只,作为正常组(ZC组),予普通饮食+生理盐水灌胃;选取SPF级ApoE-/-小鼠,日龄56d,60只,随机分为5组,每组12只。其中模型组予高脂高胆固醇饮食+生理盐水灌胃;益脉颗粒高剂量组(YF-G组)予高脂高胆固醇饮食+中药高剂量灌胃;益脉颗粒中剂量组(YF-Z组)予高脂高胆固醇饮食+中药中剂量灌胃;益脉颗粒低剂量组(YF-D组)予高脂高胆固醇饮食+中药低剂量灌胃;西药阳性药物对照组(XY组)12只予高脂高胆固醇饮食+阿托伐他汀。连续治疗12周。治疗后进行腹主动脉采血,测定血脂、TNF-α、IL-6及血浆粘度和全血高、中、低切粘度、血沉、红细胞聚集指数等指标。同时选取心肌血管组织进行组织病理学观察,选取小鼠的主动脉检测CES1,HMGCR,PPARD,PPARG等蛋白。2益脉颗粒治疗动脉粥样硬化性疾病的代谢组学研究:选取SPF级C57BL/6J小鼠,日龄28-56天,雄性,6只,作为正常组(ZC组),予普通饮食+生理盐水灌胃。选取SPF级ApoE~(-/-)小鼠,日龄28-56天,雄性,24只,随机分为4组,每组6只。其中模型组(MX组)予高脂高胆固醇饮食+生理盐水灌胃,西药阳性药物对照组(XY组)予高脂高胆固醇饮食+阿托伐他汀组,中药提取物阳性组(HP组)予高脂高胆固醇饮食+槲皮素,益脉颗粒治疗组(YF组)予高脂高胆固醇饮食+中药高剂量灌胃,持续治疗12周。治疗后对各组小鼠粪便进行非靶向的代谢组学检测,以探索研究益脉颗粒治疗动脉粥样硬化性疾病的代谢组学变化,以及生物功能的改变情况。3利用16SrDNA分析益脉颗粒对动脉粥样硬化小鼠肠道菌群影响研究:选取SPF级C57BL/6J小鼠,日龄28-56天,雄性,3只,作为正常组(ZC组),予普通饮食+生理盐水灌胃。选取SPF级ApoE~(-/-)小鼠,日龄28-56天,雄性,12只,随机分为4组,每组3只。模型组(MX组)予高脂高胆固醇饮食+生理盐水灌胃;西药阳性药物对照组(HP组)予高脂高胆固醇饮食+槲皮素;益脉颗粒治疗组(YF组)予高脂高胆固醇饮食+益脉颗粒组,持续治疗12周。治疗后将小鼠处死整理出小肠段样本后,进行总DNA提取,并进行PCR测序小鼠肠道菌群16SrDNA,以分析各组小鼠肠道菌群的多样性及物种的差异性,并将肠道菌群结果与代谢组学进行冗余分析,探寻二者之间的相关性。结果:1益脉颗粒作用机制研究:益脉颗粒所获得的潜在重叠基因靶点共计235个,同AS发病相关基因共计18个。根据益脉颗粒药物构成的各组全部重叠的基因靶点共计4个,分别为CES1,HMGCR,PPARD及PPARG。并进一步预测LXR-α、ABCA1基因,推测益脉颗粒可能通过PPAR-γ/LXR-α/ABCA1的信号通路起到治疗作用。益脉颗粒能够有效调节AS小鼠TG、TC、LDL-C、TNF-α、IL-6、血液黏度、血液聚集性等水平,益脉颗粒各组的血脂、TNF-α、IL-6、血液黏度、血液聚集性等水平接近正常水平,且随着益脉颗粒浓度的上升,与MX组比较,差异具有统计学意义(P0.05),与XY组比较,疗效相当甚至更优。益脉颗粒除了可以有效下调CES1的表达,及上调HMGCR,PPARD,PPARG的表达外,亦可通过上调PPARG下游的LXR-α/ABCA1蛋白的表达,最终实现对AS的治疗作用,作用效果且同益脉颗粒的浓度呈正比(P0.05)。YF-D、YF-Z组对CES1、PPARD、PPARG、LXR-α表达调节效果明显,与MX组比较无差异具有统计学意义(P0.05)。YF-G组对CES1,HMGCR,PPARD、PPARG、LXR-α、ABCA1蛋白表达调节效果明显,与MX组比较差异具有统计学意义(P0.05)。光镜下XY组、YF各组血管组织损伤得到修复,YF-D组、YF-Z组、YF-G组血管各部位粗细不均,管腔内未见斑块,细胞间有较少的炎性细胞浸润,YF-G组最少,伴有内膜增厚,但均较MX组薄,其中YF-G的内膜厚度较薄,YF-D组、YF-Z组肌层组织较高剂量组疏松,可见少量肌丝断裂。2益脉颗粒治疗动脉粥样硬化性疾病的代谢组学研究:鉴定出益脉颗粒能够改善AS小鼠过程中涉及的显著差异的代谢物有14种,其中已知的4-硝基肉桂酸乙酯、腐殖酸、乙酸异丁酯、1-睾酮四氢吡喃醚、多培沙明、维生素k、羊角拗醇、麦角新等8种代谢物经过治疗后显示被显著调节,正离子被下调,负离子被上调涉及的代谢通路主要包括氨基酸代谢、萜类化合物和聚酮化合物的代谢、异生素的生物降解和代谢、脂质代谢等。3利用16SrDNA分析益脉颗粒对动脉粥样硬化小鼠肠道菌群影响研究:PCoA结果显示益脉颗粒能够调节AS小鼠肠道菌群的多样性变化,其中与HP组比较在门水平上以厚壁菌门、拟杆菌门为主,在种水平以紫单胞菌种和毛螺菌种为主,在属水平以紫单胞菌属和唇形菌属为主,差异具有统计学意义(P0.05)。与ZC、MX、HP组比较,YF厌氧弧菌、肠道巴恩斯氏菌、毛螺菌水平差异显著(P0.05)。4肠道菌群与代谢产物的相关性分析Rda结果显示可以看出,螺旋体菌门对所有样本代谢物都产生正向作用,与拟杆菌门和变形杆菌门呈现负相关关系,而拟杆菌门与变形杆菌门对所有样本代谢物都产生负向作用,二者呈现正相关关系;螺旋体菌门与拟杆菌门数量变化对代谢物影响较为敏感,敏感代谢物依次为:有机杂环化合物、苯环型化合物、苯丙素和聚酮化合物、有机酸及其衍生物、脂类和脂质样分子和有机氧化合物。结论:1.益脉颗粒可以有效下调CES1的表达,上调HMGCR,PPARD,PPARG的表达,同时可通过上调PPARG下游的LXR-α/ABCA1蛋白的表达,有效调节AS小鼠血脂、血液黏度、炎症因子水平等,起到治疗AS的作用。2益脉颗粒能够改善AS小鼠过程中涉及的显著差异的代谢物有14种,其中已知的4-硝基肉桂酸乙酯、腐殖酸、乙酸异丁酯、1-睾酮四氢吡喃醚、多培沙明、维生素k、羊角拗醇、麦角新等8种代谢物经过治疗后显示被显著调节,正离子下调,负离子上调。益脉颗粒能够通过调节氨基酸代谢、萜类化合物和聚酮化合物的代谢、异生素的生物降解和代谢、脂质代谢等代谢途径,起到治疗AS的作用。3益脉颗粒能够通过改善厚壁菌门、拟杆菌门,紫单胞菌属、唇形菌属、厌氧弧菌、肠道巴恩斯氏菌、毛螺菌等,影响肠道菌群物种、结构、菌群多样性与代谢物情况,起到治疗AS的作用。同时肠道菌属(螺旋体菌门、拟杆菌门和变形杆菌门)与潜在生物标志物(有机杂环化合物、苯环型化合物、苯丙素和聚酮化合物、有机酸及其衍生物、脂类和脂质样分子和有机氧化合物)具有强相关的互作关联性。
【图文】：

心血管,阿托伐他汀,小鼠,蛋白

的表达并无显著性的上调作用，阿托伐他汀虽然可以部分上调 PPARG 的表达，使其高于MX 组和 YF-D 组（P<0.05）。但是，其表达仍然低于 YF-Z 和 YF-G 组。阿托伐他汀可以显著性的上调 HMGCR 的表达，同 YF-G 相比，有统计学差异（P<0.05）。如图1。图1 益脉颗粒对小鼠心血管靶向基因蛋白变化的影响

给药,蛋白表达,情况,热图

为进一步的确定在靶向蛋白在整个实验过程中的变化情况，取各组不同蛋白的表达量（蛋白的灰度值）的平均数，进行热图制作，以表现在药物应用过程中蛋白的变化情况，见图2。进一步对全部组别内的蛋白的表达量制作热图（沈阳创东数据处理有限公司绘制）。根据所获得的热图可知，在整个给药过程中，XY 组的 CES1表达并未随之上升，而 HMGCR 的表达量显著性的高于 YF-G 组；另，XY 组及 YF-G 组的 PPARD 的表达情况类似，，而 YF-D/Z/G各组的 PPARD 表达均显著性的高于 MX 组。而 XY组及 YF-G 组的 PPARG、LXR-α及 ABCA1蛋白表达情况类似。然而，在低剂量条件下，同 MX 组相比上述三个蛋白的表达情况并未显著上升。图 2 不同给药处理对于靶向基因蛋白表达情况的影响注：A：ZC 组；B：MX 组；C：YF-D 组；D：YF-Z 组；E：YF-G 组；F：XY 组。2.3 益脉颗粒对血脂水平的影响益脉颗粒可降低小鼠的 TG，TC，LDL-C 水平。各组降低情况均同益脉颗粒的浓度呈正比
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

【参考文献】