辐照灭菌法对生肌膏药效影响的多元化评价

发布时间：2020-04-07 22:45

【摘要】：目的:以中药血清药理学为基础,利用图谱分析技术、细胞检测技术、数理统计学以及中药谱效关系理论,考察生肌膏经辐照灭菌达到无菌标准后,是否会对药品疗效产生影响,以评价生肌膏选用辐照灭菌工艺的可行性。方法:1.家兔疮疡造模成功后,随机分成未辐照和辐照两组,分别使用辐照前后的生肌膏换药治疗。在用药第3d、6d、9d、12d、15d时观察创面愈合情况,同时取血,分离载药血清,-80℃冻存、备用;15d后处死家兔,切除创口愈合处皮肤,制成病理切片、镜下观察。另外筛选符合条件的受试者,随机分组,换药治疗,在治疗的第0d、9d,采集创面分泌物分析创面感染变化情况。2.建立载药血清中游离氨基酸指纹图谱,分析不同时间点载药血清中游离氨基酸的变化幅度及变化时间。3.采用MTT实验法,测定两个实验组不同时间点载药血清的OD值;使用流式细胞检测技术,测定两组载药血清对细胞凋亡率。分别以OD值和凋亡抑制率为评价指标,分析生肌膏辐照灭菌后对人真皮成纤维细胞增殖与凋亡的影响。4.利用上述实验所得的指纹图谱和细胞实验数据,采用SPSS及Excel统计分析软件,分别用双变量相关性分析、多元线性回归分析及灰色关联度分析等方法,对数据进行相关性分析。建立载药血清游离氨基酸和疮疡愈合疗效之间的谱效关系,分析辐照对生肌膏疗效的影响。结果:1.两实验组家兔创面愈合情况类似:用药第3d,创面肉芽组织生长,15d创面基本完全愈合。病理切片镜检可见,两组创面均有大量成纤维细胞生长,未辐照组可见大量嗜酸性细胞灶性聚集,毛细血管数量较辐照组多。受试者创面感染情况比较,无差异(P=0.881,0.05)。2.氨基酸分析仪建立载药血清游离氨基酸指纹图谱,检测牛磺酸(Tau)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、鸟氨酸(Orn)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)等17种氨基酸含量。与空白兔血清相比,除Tau和Glu外,两组均有15种游离氨基酸含量的最大降幅超过40%。未辐组降幅范围为42.58%~96.12%;辐照组为41.95%~90.64%,变化排名的前4位均是Gly、Leu、Orn和Pro,从氨基酸变化幅度分析,两组不存在差异。从含量变化时间分析,两组变化过程略有不同,但整体趋势不存在差异。3.细胞增殖和凋亡实验结果显示两组均有明显的细胞增殖促进作用和对细胞凋亡的抑制作用,但在影响时间和作用强度上存在着较为明显的差异。4.建立载药血清游离氨基酸与人真皮成纤维细胞增殖和凋亡作用的谱效关系,并进行综合评价分析。双变量相关性分析显示:Gly,Lys与细胞增殖密切相关(Pearson指数分别为0.725和0.695,P0.05);Orn与细胞凋亡抑制率密切相关(Pearson指数为-0.653,P0.05)。多元线性回归分析:将细胞增值率设定为Y1,多元回归方程为:Y_1=-1.012-0.012X_3+0.004X_4+0.001X_6+0.016X_7+0.002X_(13)+0.000X_(14)-0.017X_(15)-0.001X_(16)+0.000X_(17)(R=1.000);细胞凋亡抑制率设定为Y_2,多元回归方程为:Y_2=186.972+0.275X_3-0.032X_4-0.157X_6-0.429X_7-0.276X_(13)+0.275X_(14)+0.262X_(15)-0.134X_(16)+0.113X_(17)(R=1.000)。回归分析显示只有Ser、Glu、Ala、Val、Orn、Lys、His、Arg、Pro等9种氨基酸与成纤维细胞的增殖和凋亡有关。灰色关联度分析显示:游离氨基酸与增殖作用的关联度排序为MetLys0.7OrnIlePheProValHisTyrGluLeuAlaTauSerThrGlyArg0.6;与凋亡抑制作用的关联度排序为TauSerIlePheHisValTyrLeuThrGluArgAlaMetLysProOrn=0.700Gly0.6。综合三种统计分析结果证明:Lys与人真皮成纤维细胞增殖明显正相关;Orn与细胞的凋亡抑制明显负相关;Glu、Ala、Val、Arg等4种氨基酸与凋亡抑制负相关,而Gly则可判断为与凋亡抑制无关。比较两实验组中确认相关的游离氨基酸含量变化,未证明辐照前后的生肌膏在对真皮成纤维细胞增殖和凋亡方面的疗效存在差异。结论:通过对辐照前后生肌膏的临床疗效、载药血清氨基酸分析、载药血清对人真皮成纤维细胞增殖与凋亡的的影响以及谱效关系的分析证实:生肌膏采用辐照工艺灭菌是可行的。
【图文】：

分成两份：一份按现行包装要求分装，为未辐照生肌膏；另一份使用相同包材分装成单剂量包装（每盒约 20g），盒外用聚乙烯复合膜袋塑封，25 kGy 辐照灭菌灭菌，并经无菌检查法检验达到无菌标准，制成辐照生肌膏。1.1.1.3 仪器显微镜（BHT），日本 Olympus。生化培养箱（SPX-150 BⅢ），天津泰斯特仪器有限公司。其它：剃毛器、1 ml 注射器、10 ml 注射器、医用镊子、医用剪刀、纱布、棉球、棉拭子、医用胶带、医用系带口罩等1.1.2 实验方法1.1.2.1 建立家兔疮疡模型将家兔颈后脊柱左右两侧剃毛，面积约为 6 cm×4 cm，碘伏消毒皮肤，皮下注射 1 mL盐酸利多卡因注射液进行局部麻醉，于消毒区手术切除直径 3 cm的皮肤全层，止血后取浓度为 1 108cfu/mL金黄色葡萄球菌菌液 0.2 mL涂抹于创面，用无菌敷料覆盖包扎[37]（图 1.1）。术后正常喂食喂水，注意动物的健康状态。48h后用生理盐水浸润并打开敷料，创面有脓液生成则确认感染造模成功（图 1.2）

分成两份：一份按现行包装要求分装，为未辐照生肌膏；另一份使用相同包材分装成单剂量包装（每盒约 20g），盒外用聚乙烯复合膜袋塑封，25 kGy 辐照灭菌灭菌，，并经无菌检查法检验达到无菌标准，制成辐照生肌膏。1.1.1.3 仪器显微镜（BHT），日本 Olympus。生化培养箱（SPX-150 BⅢ），天津泰斯特仪器有限公司。其它：剃毛器、1 ml 注射器、10 ml 注射器、医用镊子、医用剪刀、纱布、棉球、棉拭子、医用胶带、医用系带口罩等1.1.2 实验方法1.1.2.1 建立家兔疮疡模型将家兔颈后脊柱左右两侧剃毛，面积约为 6 cm×4 cm，碘伏消毒皮肤，皮下注射 1 mL盐酸利多卡因注射液进行局部麻醉，于消毒区手术切除直径 3 cm的皮肤全层，止血后取浓度为 1 108cfu/mL金黄色葡萄球菌菌液 0.2 mL涂抹于创面，用无菌敷料覆盖包扎[37]（图 1.1）。术后正常喂食喂水，注意动物的健康状态。48h后用生理盐水浸润并打开敷料，创面有脓液生成则确认感染造模成功（图 1.2）
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R286.0;R285.5

【参考文献】

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本文编号：2618483