基于当归补血活血、润肠通便的有效部位筛选与化学成分分离分析

发布时间：2020-04-08 12:46

【摘要】：以甘肃道地药材当归为研究对象,基于补血活血、润肠通便的传统功效,完成三方面研究:筛选出当归润肠通便、补血、活血的有效部位;明确当归补血活血、润肠通便的药效物质基础;对当归药材中主要有效成分进行定性定量分析。主要方法及结果如下:1、以市面上各种当归制剂的提取制备方法为依据,制备当归7个不同的提取物。采用复方地芬诺酯建立小鼠便秘模型,以首次排黑便时间、6 h内排便数量、粪便重量、小肠推进率、肠水分为观察指标,比较7个不同提取部位润肠通便的作用;采用环磷酰胺(CTX)与乙酰苯肼(APH)合用建立小鼠血虚模型,以胸腺指数(TI)、脾指数(SI)、红细胞数(RBC)、白细胞数(WBC)、血小板数(PLT)、血红蛋白数(HCT)、红细胞压积(HGB)的变化为观察指标,比较7个不同提取部位补血的作用;以皮下注射盐酸肾上腺素(Adr)结合冰水浴建立急性大鼠血瘀模型,以血浆粘度(PV)、全血粘度(WBV)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原含量(FIB)为观察指标,比较7个不同提取部位活血的作用。数据首先采用SPSS 20.0统计软件处理,以?x±S表示,再采用基于变异系数权重的模糊物元模型进行综合评价。2、采用柱色谱、制备液相等方法对筛选出有效部位的化学成分进行分离、纯化,根据理化性质和波谱数据(~1H-NMR,~(13)C-NMR,DEPT等)对化合物的结构进行解析;采用超高效液相单级四极杆质谱(UPLC-MS)建立该有效部位的指纹图谱,用所掌握的对照品确定部分主要的化学成分,再根据已知化合物的分子量,推测出其他的化合物。同时,采用超高效液相建立有效部位中多成分(阿魏酸、洋川芎Qg酯I、洋川芎Qg酯H、阿魏酸松柏酯、Z-正丁基苯酞、藁本内酯、Z-丁烯基苯酞、欧当归Qg酯A)的定量分析方法。结果发现:1、润肠通便实验:与正常对照组相比,模型组首次排黑便时间延长,6h内排便粒数减少,粪便重量减轻,碳末推进率降低、肠重量减小,差异具有统计学意义(p0.05)。与模型组相比,部位1、部位2、部位3、部位5和部位6均能明显缩短首便排出时间,增加排便粒数及粪便重量,差异具有统计学意义(p0.05),部位1、部位2、部位5和部位6均能明显促进小肠运动,增强小肠推进性蠕动,增长碳末推进长度,提高碳末推进率,差异具有统计学意义(P0.05);部位1、部位2、部位3、部位5、部位6肠重量均显著增加(P0.05)。模糊物元模型计算得到的贴进度最大值为0.70(部位2,70%乙醇浸渍部位)。2、补血实验:与正常对照组比较,模型组动物胸腺指数降低(p0.01)、脾脏指数增加(p0.01),RBC、WBC、PLT、HCT、HGB均降低(P0.01),与模型组比较,阳性组(p0.01)、部位1(p0.05)组均能升高小鼠胸腺指数;阳性组及部位1-7均能降低小鼠的脾脏指数(p0.01),阳性组及当归各个给药组对小鼠RBC、WBC、PLT、HCT、HGB各有不同程度的升高,其中当归水提组及浸渍组的效果最为明显(P0.01),7个部位中,模糊物元模型计算得到的贴进度最大值为0.50(部位2,70%乙醇浸渍部位)。3、活血实验:与正常对照组相比,模型组WBV及PV均明显升高,差异具有统计学意义(p0.01),PT、APTT和TT时间缩短,其中APTT、TT差异具有统计学意义(p0.01),FIB升高,差异具有统计学意义(p0.05),与模型组比较,部位1、部位2的TT升高,差异具有统计学意义(p0.01)。部位2的PT及TT降低,差异具有统计学意义(p0.05和p0.01),7个部位中,模糊物元模型计算得到的贴进度最大值为0.527(部位2,70%乙醇浸渍部位)。4、分离、纯化,共得到20个化合物,最终确定了16个化合物的结构,分别为发卡二醇(1),欧当归Qg酯A(2),7羟基-6-甲氧基香豆素(3)、咖啡酸乙酯(4),阿魏酸(5),4?,10?-香木兰烷二醇(6),菠菜甾醇(7),4-羟基-苯乙酮(8),亚油酸(9),亚油酸三甘酯(10),亚油酸甲酯(11),β-谷甾醇(12),胡萝卜苷(13),香草醛(14),2-丙基苯酚(15),Tokinolide B(16)。5、应用UPLC-MS鉴定有效部位中的化合物,通过与对照品、其他已知化合物的分子量及相关参考文献比对,确认了8个、推测了4个化合物所代表的药效物质基础。在优化的色谱条件下,阿魏酸、洋川芎Qg酯I、洋川芎Qg酯H、阿魏酸松柏酯、Z-正丁基苯酞、藁本内酯、Z-丁烯基苯酞、欧当归Qg酯A分别在0.00174~0.0348、0.00958~0.1916、0.0016~0.032、0.00646~0.1292、0.00326~0.0652、0.00842~0.1648、0.01036~0.2072、0.00766~0.1532 mg/m L范围内线性关系良好,精密度、重复性、稳定性的RSD均小于3%。通过以上实验,筛选出了当归补血、活血、润肠通便的有效部位为70%乙醇浸渍部位;从有效部位中明确了16个化合物的结构,其中4?,10?-香木兰烷二醇(6),2-丙基苯酚(15)属首次从当归中分离得到;所建立的定性定量分析方法准确、灵敏度高,可为更加全面控制当归药材的质量提供实验依据。
【图文】：

次数,当归,润肠通便,浸膏得率

图 1 阿魏酸含量随浸渍次数的变化图re of ferulic acid content with changes in the number of imp剂的提取制备方法为依据，制备了当归 7 不同的提、水+70%乙醇回流提取法的浸膏得率均在 50%以上粉末，置干燥器内保存，以备做药效试验。第二节当归润肠通便有效部位的筛选

色谱图,浸渍物,总离子流,乙醇

图 5 70%乙醇浸渍物样品的总离子流色谱图Fig.5 Total ion chromatogram of a 70% ethanol impregnated sample在正离子模式下得到保留时间为 14.372 min 的色谱峰，MS 图谱中检测到母离子 m/z243.1[M+H]+，m/z 264.4[M+Na]+，与已知化合物的分子量对比，推测该化合物为肉豆蔻酸甲酯（methyl myristate），分子式为 C15H30O2，质谱图见附录。在正离子模式下得到保留时间为 20.896 min 的色谱峰，MS 图谱中检测到母离子 m/z237.1[M+H]+，m/z 259.2[M+Na]+，与已知化合物的分子量对比，推测该化合物为顺丁烯二酸（4-hydroxy-2,5-dimethylphenyl)maleic acid），分子为 C12H12O5，质谱图见附录。在正离子模式下得到保留时间为 36.568 min 的色谱峰，MS 图谱中检测到母离子m/z 427.3[M+H]+，m/z 449.3[M+Na]+，与已知化合物的分子量对比，，推测该化合物为羊毛甾醇（lanosterol），分子式为 C29H50O，质谱图见附录。在正离子模式下得到保留时间为 40.522 min 的色谱峰，MS 图谱中检测到母离子
【学位授予单位】：甘肃中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5;R284.2

【参考文献】