宽叶腹水草黄酮类化合物的提取纯化及生物活性研究

发布时间：2020-04-08 14:56

【摘要】：宽叶腹水草(Veronicastrum latifolium(Hemsl.)Yamazaki)为玄参科(Scrophulariaceae)腹水草属(Veronicastrum Heist.ex Farbic)植物宽叶腹水草的全草,可全草入药,主治肝硬化腹水、肾炎消肿、跌打损伤、烫伤和毒蛇咬伤。宽叶腹水草含有丰富的黄酮类化合物,黄酮类化合物具有多种生物活性如抗氧化、抑菌、抗病毒、抗炎、增强机体免疫力、降血压血脂和保护心脑血管等。因此本论文以宽叶腹水草为研究对象,采用HPLC-MS/MS对宽叶腹水草中的黄酮类化合物进行分析鉴定;首次建立了 HPLC法对黄酮类化合物进行定量分析;在定量分析的基础上对提取工艺条件进行优化,结合大孔吸附树脂对宽叶腹水草提取液中黄酮类化合物进行富集纯化;首次探讨了宽叶腹水草粗提物和纯化物的抗氧化活性、抑菌活性、抗炎活性。研究结果表明:1.通过LC-MS/MS和HPLC定性分析,鉴定出宽叶腹水草中的八种黄酮类化合物主要为牡荆素、木犀草素、汉黄芩苷、芹菜素、高车前素、金圣草黄素、金合欢素、柳穿鱼黄素;建立的 HPLC 色谱条件:色谱柱:Diamonsil C18 column,(250 × 4.6 mm i.d..5 μm),流动相:A为0.5%的磷酸水溶液,B为乙腈;梯度洗脱条件为:0-6 min,10-15%(B);6-7 min,15-18%(B);7-30 min,18-25%(B);30-65 min,25-40%(B);65-85 min,40-52%(B);检测波长为 350 nm;柱温为35℃;流速为0.8mL/min;进样量为20μL。证实此法可成功的用于宽叶腹水草中主要黄酮类化合物的定性和定量分析。2.在单因素实验的接础上,结合响应曲面法实验考察了微波辅助提取宽叶腹水草中牡荆素、木犀草素、汉黄芩苷、芹菜素、高车前素、金圣草黄素、金合欢素、柳穿鱼黄素的工艺条件,并确定了最工艺条件:70%的乙醇为溶剂,微波温度为56℃,微波时间为14min,间液比为1:48(g/mL)。在最佳工艺条件下,宽叶腹水草中的牡荆素、木犀草素、汉黄芩苷、芹菜素、高车前素、金圣草黄素、金合欢素、柳穿鱼黄素的提取率分别为0.284 mg/g、0.298 mg/g、5.59 mg/g、0.161 mg/g、0.297 mg/g、0.263 mg/g、0.285 mg/g、0.781 mg/g。证实此法对宽叶腹水草中的黄酮类化合物提取率比价高,该提取工艺完全可行。D101树脂对宽叶腹水草中黄酮类化合物的吸附率、解吸率、纯度及回收率分别为83.7%、81.2%、88.5%、41.4%,表明D101树脂适用于宽叶腹水草黄酮类化合物的富集纯化。经D101树脂富集纯化后,宽叶腹水草纯化物中黄酮类化合物的纯度与粗提物相比,其纯度提高了 9.36倍。3.以Vc为对照,对宽叶腹水草的粗提物和纯化物进行DPPH自由基清除实验、ABTS自由基清除实验、FRAP总抗氧化能力实验,在三种抗氧化实验中,粗提物和纯化物均具有抗氧化作用,且纯化物的抗氧化能力均强于粗提物。选择革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、白色念球菌、枯草芽孢杆菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌、鲍曼不动杆菌)进行宽叶腹水草粗提物和纯化物的抑菌活性研究,纯化物和粗提物对六种供试菌株表现出一定的抑制作用,但对革兰氏阳性菌的抑制作用明显强于革兰氏阴性菌;纯化物对六种供试菌株的抑菌作用强于粗提物,且纯化物对白色念球菌的抑菌作用最强。采用MTT法测定25-500 μg/mL范围内的粗提物和纯化物对RAW 264.7细胞活力的影响。研究发现,在25-300 μg/mL浓度范围内,粗提物和纯化物对细胞活力无显著影响;经LPS诱导致炎的RAW 264.7巨噬细胞,通过Griess法检测给药后细胞NO的分泌量,研究发现宽叶腹水草粗提物和纯化物均抑制了NO的分泌量,且纯化物的抑制作用强于粗提物,验证了宽叶腹水草粗提物和纯化物具有抗炎作用,且纯化物的抗炎效果强于粗提物。
【图文】：

色谱,腹水草,宽叶,酮类

２．３结果与分析逡逑２．３．１黄酮类成分的鉴定逡逑图２－１为通过ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析得到的宽叶腹水草中黄酮类成分的总离子流图，将该总离逡逑子流图进一步分析得到相关黄酮成分的一级质谱和二级质谱图。通过分析ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ获得的逡逑宽叶腹水草一级质谱数据从而得到黄酮类成分的准分子离子峰，确定可能的分子量，如表２－２逡逑所示。根据正离子模式下获得的宽叶腹水草黄酮类成分的二级质谱数据，获得相关结构碎片逡逑离子信息。通过分析裂解规律，参考相关文献报道及标准品色谱液相色谱图信息，从宽叶腹逡逑水草叶中鉴定出八个黄酮类成分（化学结构式如图２－２所示）。逡逑ｊｋ邋Ｓｊｒｖｓ；：逦ｔ：．邋Ｓｇ－＊ｓ；逡逑１００％邋＼逡逑ｍ邋３．００逦４１．６３逡逑＾逦３．８６逡逑２．４７逦７７．３４逡逑Ｍ逦２８．９５逦４６．３３逡逑ｃ逦Ｉ逦丨逦９１．１７逡逑ｉ邋６0％逦；邋３．６５逦１１．６６逦２0．８６逦３７．２０逦９１－５９｜邋９２１４逡逑：＞逦５０％邋＼ｌ逦ｉ邋ｉｃ邋ｉｎ１６Ｊ０逦７８．８５逦；逦？逡逑３０％逦，，，邋１０．３８邋（ｉｊｌｒＷ邋ｊｒＰ＾－７０＾ｒＴ邋ｒ＾２Ｔ邋＾Ｍ邋７４；８９逦｜逦８８．２２邋＾逦？逡逑＜逦ｖ逡逑0％邋—邋二逦逦逦逦逦＊逦逦

二级质谱,质谱,母离子,碎片离子

逑ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ逡逑图２－６为高车前素的多级质谱图。在该化合物的一级质谱图中，负离子模式下扫描的ｍ／ｚ逡逑２９９．０５６６为［Ｍ－Ｈｒ峰，表明该化合物的相对分子质量为３００。对ｍ／ｚ邋２９９．０５６６母离子进行逡逑二级质谱扫描，可获得的主要二级质谱碎片离子６５．０６６，１３６．９８８４，２２７．０３５，，２８３．０２５，２８４．０３３４，逡逑其中ｍ／ｚ邋２８３．０２５和ｍ／ｚ邋２８４．０３３４为母离子ｍ／ｚ邋２９９．０５６６分别丢失一分子的Ｏ和ＣＨ３获得碎逡逑片离子［Ｍ－Ｈ－0ｒ邋和［Ｍ－Ｈ－邋ＣＨ３］＿，ｍ／ｚ邋１３６．９８８４邋由邋ｍ／ｚ邋２９９．０５６６邋母离子丢失一分子邋ＣＨ３邋后逡逑经过１、４号键断裂后产生碎片离子［Ｍ－Ｈ－ＣＨＭ１，４］＇根据表２－２质谱数据、裂解规律及相逡逑关文献＠＿８７１，经过与标准物质高车前素的比对，该化合物被鉴定为高车前素。逡逑Ａ逡逑Ｓｐｅｃｔｒｕｍ邋ｆｒｏｍ邋ｓａ－ｎｅｇ２．ｗｉｆ（邋（ｓａｍｐｌｅ邋１）邋－邋Ｓａｍｐｌｅ００２，邋Ｅｘｐｅｉｉｍｅｎｔ邋１．邋－ＴＯＦ邋ＭＳ邋（１００邋－邋２０００）邋ｆｒｏｍ邋５４．５８６邋ｍｉｎ逡逑３0ｅ５逦＞９９．０５６６逡逑２邋５ｅ５逡逑２．０ｅ５逡逑｜逦１．５ｅ５逡逑１逦１．０ｅ５逦３０００６０３逡逑５０，４逦２８４０３２７逡逑Ｏ．ＯｅＯ邋Ｈ逦
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284;R285

【参考文献】