【摘要】：神经系统和免疫系统相互之间存在着双向调节机制,一个系统的改变会影响另外一个系统的功能。神经系统可通过神经递质、神经肽等生物活性物质调节免疫系统功能,免疫系统可通过细胞因子等免疫活性物质调节神经系统功能,导致神经精神及行为等的改变。其中,外周免疫系统对中枢学习记忆功能的影响是近年生命科学的研究热点之一。为了研究免疫功能异常对中枢学习记忆功能的影响,本课题选取三种代表性先天性免疫缺陷小鼠和一种获得性免疫功能异常,即脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导所致免疫功能异常小鼠,观察免疫功能异常对学习记忆能力的影响。在此基础上,研究了中药经典方剂六味地黄汤(LW)及其活性部位LW-AFC的改善作用及其可能的机制。取得的结果包括以下两部分:第一部分免疫功能异常对学习记忆能力的影响1.先天性免疫缺陷小鼠学习记忆能力的研究先天性免疫缺陷小鼠中,Nude小鼠先天无胸腺,不能使T细胞正常分化,造成T淋巴细胞缺陷;SCID小鼠表现出严重的联合免疫缺陷症状,T、B淋巴细胞功能均缺失,但有正常的NK细胞、巨噬细胞和粒细胞;NOD-SCID小鼠T、B淋巴细胞和NK细胞功能缺失。选取2月龄雄性Nude(BALB/c系)、SCID、NOD-SCID三种免疫缺陷小鼠,以BALB/c小鼠作为对照。Morris水迷宫实验结果显示,与BALB/c小鼠相比,SCID小鼠测试期逃避潜伏期、穿环次数和目标象限停留时间无明显变化;NOD-SCID小鼠测试期逃避潜伏期明显降低(P0.05),穿环次数和目标象限停留时间无明显变化。穿梭箱实验结果显示,与BALB/c小鼠相比,Nude小鼠测试期主动回避次数明显降低(P0.01);SCID和NOD-SCID小鼠测试期主动回避次数无明显变化,提示T淋巴细胞缺陷的Nude小鼠主动回避学习记忆能力明显下降。以上实验结果表明,先天性T细胞缺陷可能会导致动物学习记忆能力降低。2.LPS诱导免疫功能异常对小鼠学习记忆能力的影响LPS是革兰氏阴性菌细胞壁中的一种脂质和多糖的复合物,腹腔注射LPS后,引发炎症反应,在杀伤、清除病原体的同时也对宿主组织细胞产生损害反应,引起免疫损伤。本研究采用单次腹腔注射LPS所致急性免疫功能异常和长期多次腹腔注射LPS所致慢性免疫功能异常小鼠研究获得性免疫功能异常对中枢学习记忆功能的影响。2.1单次腹腔注射LPS对小鼠学习记忆能力的影响选取2-3月龄雄性C57小鼠,环境适应后进行Morris水迷宫实验,每天实验1次,共进行6天,前1-5天为训练期,第6天为测试期。分别于第1天学习前、第1天学习后、第3天学习前、第6天(测试期)前单次腹腔注射LPS(250μg/kg)观察LPS对学习记忆中获取、巩固和提取信息能力的影响。结果显示,第1天学习前注射LPS,与对照组相比,模型组小鼠学习期和测试期各指标均无明显变化,提示LPS对小鼠学习记忆获取可能无明显影响;第1天学习后立即注射LPS,与对照组相比,模型组小鼠第2天逃避潜伏期显著增加(P0.05),后续学习期和测试期各指标均无明显变化,提示LPS可能影响了小鼠的学习记忆提取;第3天学习前和第6天测试前分别注射LPS,与对照组相比,模型组小鼠学习期和测试期各指标均无明显变化,提示LPS对小鼠的学习记忆巩固可能无明显影响。以上结果提示,第1天学习后单次腹腔注射LPS(250μg/kg)可以显著降低小鼠学习记忆中巩固和提取信息的能力,这可能与腹腔注射LPS导致的炎性反应有关。为确定上述学习记忆能力的损伤是否与LPS导致的免疫炎性反应有关,进而观察了发生上述学习记忆损伤的时间小鼠自主活动、游泳速度、体重、体温、痛觉反应及血浆和海马中的细胞因子等指标的变化。结果显示,小鼠自主活动性、体重、体温显著降低(P0.001),游泳速度和痛觉反应无明显变化;血浆和海马中IL-6水平显著增加(P0.001)。以上结果提示,第1天学习后注射LPS引起的空间学习记忆损伤可能与LPS导致的免疫炎性反应有关。2.2长期腹腔注射LPS对小鼠学习记忆能力的影响选取2月龄雄性C57小鼠,连续腹腔注射LPS(250μg/kg,1次/天)2个月后进行Morris水迷宫实验。结果显示,与对照组相比,模型组小鼠学习期逃避潜伏期显著延长(P0.01);测试期逃避潜伏期显著延长(P0.001),穿环次数和目标象限停留时间显著降低(P0.001)。以上结果提示长期腹腔注射LPS(250μg/kg)能够明显损伤小鼠空间学习记忆能力。第二部分LW及其活性部位对LPS所致学习记忆损伤的作用及机制研究六味地黄方(LW)是中医“滋阴补肾”的经典代表名方,LW-AFC是从六味地黄汤中分离获得的由活性成分群构成的组分中药新药。已有研究表明,LW对于免疫功能低下动物的免疫功能具有改善作用;LW-AFC可显著改善快速老化模型小鼠SAMP8和APP/PS1转基因AD模型小鼠的学习记忆能力。但LW及其活性部位LW-AFC对LPS所致学习记忆损伤是否具有改善作用尚不明确。1.LW及其活性部位对正常小鼠学习记忆能力的影响选取3月龄雄性C57小鼠,灌胃给予LW(1.17g/kg)和LW-AFC(0.4g/kg、0.8g/kg、1.6g/kg,1次/天,连续4周),通过Morris水迷宫实验观察不同给药时间对正常小鼠空间学习记忆能力的影响。与对照组相比,给予LW和LW-AFC1周、2周及4周后,小鼠学习期和测试期逃避潜伏期等指标均无明显变化。以上结果提示,灌胃给予LW及其活性部位,小鼠空间学习记忆能力不受影响。2.LW及其活性部位对LPS所致学习记忆损伤的作用2.1 LW及其活性部位对单次腹腔注射LPS所致学习记忆损伤的影响选取3月龄雄性C57小鼠,分别灌胃给予LW(1.17g/kg)、LW-AFC(0.4g/kg、0.8g/kg、1.6g/kg)及阳性药 TLR4 抑制剂 TAK-242(3mg/kg,ip)两周后进行Morris水迷宫实验,并于第1天学习后单次腹腔注射LPS(250μg/kg),观察其对小鼠学习记忆功能损伤的作用。结果显示,与对照组相比,腹腔注射LPS后第2天模型组小鼠逃避潜伏期明显延长(P0.05),TAK-242组小鼠对其具有明显改善作用(P0.05),LW及LW-AFC组小鼠逃避潜伏期无明显变化,且对测试期逃避潜伏期、穿环次数和目标象限停留时间无明显影响。以上结果提示,LW、LW-AFC不能改善单次腹腔注射LPS(250μg/kg)所致空间学习记忆能力损伤。2.2 LW及其活性部位对长期腹腔注射LPS所致学习记忆损伤的影响选取3月龄雄性C57小鼠,连续腹腔注射LPS(250μg/kg,1次/天)2个月,同时分别灌胃给予LW(1.17g/kg)、LW-AFC(1.6g/kg),腹腔注射给予阳性药(TAK-242,3mg/kg),然后进行Morris水迷宫实验。结果显示,与对照组相比,模型组小鼠测试期逃避潜伏期显著延长(P0.001)、穿环次数显著减少(P0.05)及目标象限停留时间显著缩短(P0.01)。与模型组相比,LW、LW-AFC可显著缩短小鼠测试期逃避潜伏期(P0.001)、增加穿环次数(P0.05)以及延长目标象限停留时间(P0.05),与阳性药TLR4抑制剂TAK-242作用相当。以上结果提示,LW和LW-AFC可以改善长期腹腔注射LPS所致空间学习记忆能力损伤。3.LW及其活性部位改善LPS所致学习记忆损伤的机制腹腔注射LPS会引起免疫炎性反应,产生的小分子炎性物质入脑后引起小胶质细胞的激活,进而导致脑内神经炎症,引起学习记忆损伤。根据第一部分研究结果,选取腹腔注射后发生学习记忆损伤的时间(14hr)以及学习记忆损伤得到恢复的时间(5天)取小鼠血浆和全脑进行生化指标检测。采用免疫荧光染色观察脑内小胶质细胞的激活。结果显示,学习记忆损伤时,与对照组相比,模型组全脑Ibal+细胞积分光密度(integral optical density,IOD)明显增加(P0.01);阳性药TLR4抑制剂TAK-242对其有明显的降低作用(P0.001);LW、LW-AFC可显著降低全脑Ibal+细胞IOD(P0.001)。学习记忆损伤得到恢复时,与对照组相比,模型组小鼠全脑Ibal+细胞IOD无明显变化;与模型组相比,TAK-242、LW及LW-AFC对小鼠脑中Ibal+细胞IOD无明显影响。结果提示腹腔注射LPS后小鼠脑中小胶质细胞激活,LW、LW-AFC能够抑制小胶质细胞的活化。采用Luminex技术检测血浆和海马中促炎因子(IL-6、TNF-α、IL-1 β、RANTES、MCP-1、GM-CSF、IFN-γ)和抗炎因子(IL-4、IL-10)以及血管内皮生长因子(VEGF)的含量。结果显示,学习记忆损伤时,与对照组相比,模型组血浆和海马中促炎因子IL-6、RANTES水平显著升高(P0.001)、血浆中抗炎因子IL-10水平显著降低(P0.001),TAK-242可显著降低促炎因子水平(P0.05);与模型组相比,LW-AFC组海马中促炎因子IL-6、MCP-1的水平显著降低(P0.05)。学习记忆损伤得到恢复时,与对照组相比,模型组血浆和海马中炎性相关细胞因子水平无明显变化。以上结果提示腹腔注射LPS后小鼠血浆和海马中促炎因子水平升高、抗炎因子水平降低;LW-AFC能够抑制促炎性细胞因子的释放。以上论述说明LW-AFC能够直接抑制小胶质细胞的活化,进而降低海马中升高的炎性细胞因子水平来改善LPS所致学习记忆损伤。综合以上研究结果,本研究可以得出以下结论:1.先天性T淋巴细胞缺陷会降低主动回避学习记忆能力。2.腹腔注射LPS所致免疫功能异常会引起中枢学习记忆损伤。3.给予LW、LW-AFC不影响正常小鼠的学习记忆能力。4.LW、LW-AFC能够改善腹腔注射LPS所致免疫功能异常引起的中枢学习记忆损伤,这可能是通过抑制脑内小胶质细胞的活化和降低血浆及海马中升高的炎性细胞因子水平来实现。
【图文】：
２．２．１邋ＬＷ及其活性部位对单次腹腔注射ＬＰＳ所致学习记忆损伤的影响逡逑在Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实验的空间学习期第一天结束后单次腹腔注射ＬＰＳ，与对照组相比，逡逑模型组小鼠学习期第二天潜伏期明显延长，而ＴＡＫ－２４２组潜伏期显著低于模型组（图２－７Ａ）。逡逑结果说明，阳性药ＴＡＫ－２４２可以显著改善小鼠学习期的学习记忆能力。在空间记忆期，与逡逑对照组相比，模型组逃避潜伏期有延长的趋势、穿环次数和目标象限停留时间有减少的趋逡逑势；与模型组相比，，ＬＷ、ＬＷ－ＡＦＣ组逃避潜伏期有缩短的趋势，穿环次数和目标象限停留逡逑时间有增加的趋势（图２－７Ｂ，Ｃ，Ｄ）。说明ＬＷ、ＬＷ－ＡＦＣ有改善ＬＰＳ所致急性炎症模型小鼠逡逑学习记忆能力损伤的趋势。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑６０１逦６０－逡逑５０．逦0逦５０－逦＊逡逑ｒ逦ｒ．邋？？
■■逡逑注：小鼠全脑染色（ｘｌ４）邋：邋Ａ．空白对照组；Ｂ．模型组；Ｃ．阳性药组；Ｄ．六味地黄组；Ｅ．六味地黄苷糖组。逡逑小鼠海马区域染色（ｘ６０）邋：邋Ｆ．空白对照组；Ｇ．模型组；Ｈ．阳性药组；Ｉ．六味地黄组；Ｊ．六味地黄苷糖组，逡逑图２－９邋ＬＷ及其活性部位对全脑及海马小胶质细胞活化的影响（腹腔注射ＬＰＳ邋１４ｈｒ后）逡逑ＩＨＨ逡逑■■逡逑注：小鼠全脑染色（Ｍ４）邋：邋Ｋ．空白对照组；Ｌ．模型组；Ｍ．阳性药组；Ｎ．六味地黄组；０．六味地黄苷糖组。逡逑小鼠海马区域染色（ｘ６０）邋：邋Ｐ．空白对照组；Ｑ．模型组；Ｒ．阳性药组；Ｓ．六味地黄组；Ｔ．六味地黄苷糖组。逡逑图２－１０邋ＬＷ及其活性部位对全脑及海马区小胶质细胞活化的影响（腹腔注射ＬＰＳ邋５天后）逡逑３５逡逑
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
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本文编号：
2619539
