补肺益肾方调控NF-κB通路抑制MRC-5细胞炎症反应的机制

发布时间：2020-04-08 22:13

【摘要】：目的通过观察补肺益肾方对香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导的MRC-5细胞增殖、凋亡、细胞因子、基质金属蛋白酶和细胞外基质的分泌、细胞转化及核转录因子(nuclear factor,NF)-κB信号通路相关基因、蛋白表达水平的影响,探讨补肺益肾方抑制CSE诱导的MRC-5细胞炎症反应的机制。方法将MRC-5细胞分为空白组(Control)、补肺益肾组(Bufei Yishen group,BY)、氨茶碱组(aminophylline group,Am)、CSE组、CSE+BY组、CSE+Am组、si RNA组、si RNA+BY组、si RNA+Am组、si RNA+CSE组、si RNA+CSE+BY组和si RNA+CSE+Am组,采用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(carboxyfluorescein discrete succinimide ester,CFSE)法标记,采用流式细胞术检测各组细胞增殖情况,Annexin V-FITC联合PI标记,采用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,采用ELISA法检测各组细胞培养液中IL-1β、IL-8、TNF-α、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1、FN、LN、COL-I、COL-III和COL-IV的水平,采用细胞免疫荧光技术检测各组MRC-5细胞中α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,α-SMA)的表达,采用荧光定量PCR技术,检测MRC-5 IL-1β、TNF-α、TGF-β1、NF-κB p65和I-κBαm RNA表达水平,采用Western-Bloting技术测定MRC-5细胞中NF-κB p65和I-κBα的蛋白表达水平。结果1细胞增殖与Control组比较,BY和Am组细胞增值率均有所升高(P0.05),而CSE组明显降低(P0.05);与CSE组比较,CSE+BY和CSE+Am组有所升高(P0.05);CSE+BY与CSE+Am组比较无统计学意义(P0.05);与si RNA组比较,si RNA+BY和si RNA+Am组均升高(P0.05),而si RNA+CSE组降低(P0.05);与si RNA+CSE组比较,si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am组有所下降(P0.05);si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am组比较无统计学意义(P0.05)。NF-κB p65si RNA组与non-NF-κB p65组比较,si RNA+CSE+BY组无统计学意义(P0.05),其它组均升高(P0.05)。2细胞凋亡与Control组比较,BY组细胞凋亡率有所降低(P0.05),Am组无统计学差异(P0.05),而CSE组明显升高(P0.05);与CSE组比较,CSE+BY和CSE+Am组有所降低(P0.05);CSE+BY比CSE+Am组降低更多(P0.05);与si RNA组比较,si RNA+BY和si RNA+Am组无统计学差异(P0.05),而si RNA+CSE组升高(P0.05);与si RNA+CSE组比较,si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am无统计学差异(P0.05);si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am组比较无统计学意义(P0.05)。NF-κB p65 si RNA组与non-NF-κB p65组比较均降低(P0.05)。3 IL-1β、IL-8、TNF-α、TGF-β1与Control组比较,BY组、Am组和CSE组细胞培养液中IL-1β、IL-8、TNF-α和TGF-β1的水平均升高(P0.05);与CSE组比较,CSE+BY组和CSE+Am组均降低(P0.05);CSE+BY与CSE+Am组比较,IL-1β和IL-8降低更明显(P0.05)而TNF-α和TGF-β1无统计学意义(P0.05);与si RNA组比较,si RNA+BY、si RNA+Am和si RNA+CSE组均升高(P0.05);与si RNA+CSE组比较,si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am组均降低(P0.05);si RNA+CSE+BY与si RNA+CSE+Am组比较,IL-1β、IL-8和TNF-α降低更多(P0.05)而TGF-β1无统计学意义(P0.05);NF-κB p65 si RNA组与non-NF-κB p65组比较均降低(P0.05)。4 MMP-9、TIMP-1与Control组比较,CSE组细胞培养液中MMP-9和TIMP-1均升高(P0.05),BY组和Am组均无统计学意义(P0.05);与CSE组比较,CSE+BY组和CSE+Am组均降低(P0.05);CSE+BY与CSE+Am组比较无统计学意义(P0.05);与si RNA组比较,si RNA+CSE组均升高(P0.05),si RNA+BY组和si RNA+Am组无统计学意义(P0.05);与si RNA+CSE组比较,si RNA+CSE+BY组和si RNA+CSE+Am组均降低(P0.05);si RNA+CSE+BY与si RNA+CSE+Am组比较无统计学意义(P0.05)。NF-κB p65 si RNA组与non-NF-κB p65组比较,MMP-9降低(P0.05)而TIMP-1无统计学意义(P0.05)。5细胞外基质与Control组比较,CSE组细胞培养液中FN、LN、COL-I、COL-III和COL-IV均升高(P0.05),BY组和Am组均无统计学意义(P0.05);与CSE组比较,CSE+BY组均降低(P0.05),CSE+Am组COL-I、COL-III和COL-IV均降低(P0.05)而FN、LN无统计学意义(P0.05);CSE+BY与CSE+Am组比较,FN和LN降低(P0.05),COL-I、COL-III和COL-IV无统计学意义(P0.05);与si RNA组比较,si RNA+CSE组升高(P0.05),si RNA+BY组和si RNA+Am组无统计学意义(P0.05);与si RNA+CSE组比较,si RNA+CSE+BY组降低(P0.05),si RNA+CSE+Am组COL-I、COL-III和COL-IV降低(P0.05),FN和LN无统计学意义(P0.05);si RNA+CSE+BY与si RNA+CSE+Am组比较,FN和LN降低(P0.05)而COL-I、COL-III和COL-IV无统计学意义(P0.05)。NF-κB p65si RNA组与non-NF-κB p65组比较均降低(P0.05)。6α-SMA与Control组比较,CSE组α-SMA表达升高(P0.05),BY和Am组均无统计学意义(P0.05);与CSE组比较,CSE+BY和CSE+Am组降低(P0.05);CSE+Am比CSE+BY组降低(P0.05);与si RNA组比较,si RNA+CSE组表达升高(P0.05),si RNA+BY和si RNA+Am组无统计学意义(P0.05);与si RNA+CSE组比较,si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am组降低(P0.05);si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am组比较无统计学意义(P0.05);NF-κB p65 si RNA组与non-NF-κB p65组比较,si RNA+CSE组、si RNA+CSE+BY组和si RNA+CSE+Am组Am组均减少(P0.05),其它组均无统计学意义(P0.05)。7 IL-1β、TNF-α和TGF-β1 m RNA与Control组比较,BY、Am组和CSE组细胞中IL-1β、TNF-α和TGF-β1 m RNA的表达均升高(P0.05);与CSE组比较,CSE+BY和CSE+Am组均降低(P0.05);CSE+BY与CSE+Am组比较,IL-1β升高(P0.05)而TNF-α和TGF-β1 m RNA无统计学意义(P0.05);与si RNA组比较,si RNA+BY、si RNA+Am组和si RNA+CSE组均升高(P0.05);与si RNA+CSE组比较,si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am组均降低(P0.05);si RNA+CSE+BY与si RNA+CSE+Am组比较,IL-1β和TNF-αm RNA降低(P0.05)而TGF-β1 m RNA无统计学意义(P0.05);NF-κB p65 si RNA组与non-NF-κB p65组比较均降低(P0.05)。8 NF-κB p65和I-κBαm RNA与Control组比较,CSE组细胞中NF-κB p65和I-κBαm RNA表达均升高(P0.05),BY和Am组均无统计学意义(P0.05);与CSE组比较,CSE+BY和CSE+Am组均降低(P0.05);CSE+BY与CSE+Am组比较均降低(P0.05);与si RNA组比较,si RNA+CSE组均升高(P0.05),si RNA+BY和si RNA+Am组无统计学意义(P0.05);与si RNA+CSE组比较,si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am组均降低(P0.05);si RNA+CSE+BY与si RNA+CSE+Am组比较均降低(P0.05);NF-κB p65 si RNA组与non-NF-κB p65组比较,NF-κB p65均降低(P0.05)而I-κBαm RNA无统计学意义(P0.05)。9 NF-κB p65和I-κBα蛋白与Control组比较,BY和Am组细胞中NF-κB p65和I-κBα蛋白均无统计学意义(P0.05),而CSE组升高(P0.05);与CSE组比较,CSE+BY和CSE+Am组有所降低(P0.05);CSE+BY比CSE+Am组降低更多(P0.05);与si RNA组比较,si RNA+BY和si RNA+Am组无统计学意义(P0.05),而si RNA+CSE组升高(P0.05);与si RNA+CSE组比较,si RNA+CSE+BY和si RNA+CSE+Am有所降低(P0.05);si RNA+CSE+BY比si RNA+CSE+Am组降低更多(P0.05)。si RNA与Control组,si RNA+BY与BY组,si RNA+Am与Am组,si RNA+CSE与CSE组,si RNA+CSE+BY与CSE+BY组,si RNA+CSE+Am与CSE+Am组比较细胞中NF-κB p65蛋白的相对表达均降低(P0.05)而I-κBα蛋白无统计学意义(P0.05)。10指标的相关性分析经分析后发现,呈高度相关程度(相关系数r"g0.8)以上的有:NF-κB p65与IL-1β(r=0.934,P=0.000)、IL-8(r=0.942,P=0.000)、TNF-α(r=0.926,P=0.000)、TGF-β1(r=0.938,P=0.000)、MMP-9(r=0.932,P=0.000)、FN(r=0.903,P=0.000)、LN(r=0.877,P=0.000)、COL-I(r=0.928,P=0.000)、COL-III(r=0.980,P=0.000)、COL-IV(r=0.915,P=0.000)、α-SMA(r=0.861,P=0.000)和NF-κB p65 m RNA(r=0.950,P=0.000);MMP-9与TIMP-1(r=0.857,P=0.000)、FN(r=0.823,P=0.001)、LN(r=0.842,P=0.001)、COL-I(r=0.986,P=0.000)、COL-III(r=0.963,P=0.000)、COL-IV(r=0.949,P=0.000);TIMP-1与LN(r=0.893,P=0.000)、COL-I(r=0.914,P=0.000)、COL-III(r=0.806,P=0.002)、COL-IV(r=0.937,P=0.000);IL-1β与IL-1βm RNA(r=0.935,P=0.000);TNF-α与TNF-αm RNA(r=0.910,P=0.000);TGF-β1与TGF-β1 m RNA(r=0.823,P=0.001);I-κBα与I-κBαm RNA(r=0.971,P=0.000)。结论1 NF-κB p65 si RNA的转染对细胞凋亡、炎症细胞因子、基质金属蛋白酶、细胞外基质的分泌有明显抑制作用。2补肺益肾方能够有效促进CSE诱导的MRC-5细胞增殖,抑制其凋亡,降低炎症细胞因子、基质金属蛋白酶和细胞外基质的分泌,减少细胞转化,其机制可能通过下调NF-κB通路抑制CSE诱导的MRC-5细胞炎症反应,降低气道慢性炎症的进程,进而延缓COPD气道重塑。3单一因素刺激的细胞实验不能完全模拟体内的病理情况,进一步研究时可以选取不同浓度的CSE或细胞共培养进行试验。
【图文】：

统计学

图 1 各组细胞增殖率的比较（—χ ±s）与 Control 组比较，▲P<0.05；与 CSE 组比较，，★P<0.05；CSE+Am 与 CSE+BY 组0.05；与 siRNA 组比较，■P<0.05；与 siRNA+CSE 组比较，●P<0.05；siRNA+CSiRNA+CSE+BY 组比较，%糚<0.05；non-NF-κB p65 与 NF-κB p65 siRNA 组比较，#P<RC-5 细胞凋亡率的比较与 Control 组比较，BY 组细胞凋亡率降低（P<0.05），Am 组无统计学>0.05），而 CSE 组明显升高（P<0.05）；与 CSE 组比较，CSE+BY 和 CSE所降低（P<0.05）；CSE+BY 比 CSE+Am 组降低更多（P<0.05）；与 s较，siRNA+BY 和 siRNA+Am 组无统计学差异（P>0.05），而 siRNA+C（P<0.05）；与 siRNA+CSE 组比较，siRNA+CSE+BY、siRNA+CSE+A学差异（P>0.05）；siRNA+CSE+BY 和 siRNA+CSE+Am 组比较无统计学>0.05）。NF-κB p65 siRNA 组与 non-NF-κB p65 组比较均降低（P<0.05）

补肺益肾方调控NF-κB通路抑制MRC-5细胞炎症反应的机制

各组细胞凋亡率的比较（—χ±s）
【学位授予单位】：河南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】