PD-L1在角质形成细胞中的功能、调控及靛玉红干预研究

发布时间：2020-04-09 11:24

【摘要】：银屑病是免疫相关的慢性炎症性疾病,由于其难治性及高复发性,给患者身体带来极度不适,对患者家庭、经济及精神上也带来很大压力。尽管银屑病的药物治疗史已有上百年,但银屑病的发病机制至今仍未阐明,并且目前的药物并不能完全治愈银屑病。因此,需要医学药学人员继续深入探讨银屑病的作用机制,以望找到更优的银屑病治疗药物。本实验室前期通过基因芯片技术分析了3个健康人皮肤及3个银屑病患者皮损处皮肤差异基因的表达,发现了多个在银屑病致病机制中具有重要作用的基因。随着测序技术的发展,高通量转录组测序代替基因芯片成为生物分析的热点。本研究借助高通量转录组测序技术,发现了免疫检查点程序性细胞死亡1(programmed cell death 1,PD-1)相关的配体,程序性细胞死亡配体1(programmed cell death ligand1,PD-L1),在银屑病中有着异常表达。进而围绕PD-L1,对其在银屑病角质形成细胞中的功能、调控展开研究,并初步探讨验证可能与PD-L1相关的药物靛玉红在银屑病中的治疗作用。第一章寻常性银屑病的转录组测序目的:探讨中国人群寻常性银屑病的发病机制,找寻此疾病中的重要靶基因。方法:收集银屑病皮损皮肤和健康人皮肤,提取RNA进行转录组测序。根据测序结果筛选差异基因,并与已报道的差异基因进行比对。对差异表达基因进行gene ontology(GO)、pathway、共表达网络等生物信息学分析,寻找银屑病发病机制中重要的靶基因。并对找到的靶基因进行免疫组化验证。结果:本次测序共发现2597个差异基因。其中编码基因2139个,非编码基因458个。与已报道的差异基因相比,新发现包括HACL1、ACAA、TECR、GADD45G、SH2D1A、ITGAV,SH2D1A等在内的1676个差异基因。编码基因中1335个基因在银屑病组中显著上调,804个基因下调。上调基因的生物学功能主要与细胞周期、免疫反应、炎症反应、角质形成细胞分化等相关,下调基因功能主要集中在脂肪酸合成与代谢、脂质代谢和病毒转录等方面。通过pathway分析,发现细胞因子间相互作用通路、代谢通路、NFκB信号通路、PPAR信号通路、NOD样受体信号通路、RIG-I样受体信号通路、趋化因子信号通路、细胞周期、凋亡、脂肪酸降解通路、过氧化物酶、T细胞受体信号通路、紧密连接、JAK-STAT信号通路、及Toll样受体信号通路等在银屑病中有着重要作用。通过共表达网络分析得到在银屑病中占重要地位的49个基因,包括IL-17A、IL-26、PD-L1等。本研究选定目前研究热点PD-L1作为靶基因深入探讨,免疫组化结果显示,PD-L1在健康人皮肤角质形成细胞中有正常表达,而在银屑病患者中显著降低。结论:中国人寻常性银屑病转录组测序筛选出的差异基因与文献已报道的存在一定程度的差异。转录组测序在探讨银屑病致病机制方面能够发挥很大优势。PD-L1在银屑病患者皮损角质形成细胞处的低表达可能参与了银屑病的致病机制。第二章利用CRISPR/Cas9技术构建PD-L1敲除的角质形成细胞模型目的:构建人表皮角质形成细胞PD-L1基因敲除的稳转细胞株,以便研究PD-L1在银屑病角质形成细胞或其它PD-L1低表达的皮肤疾病中的作用。方法:根据PD-L1序列,设计3对gRNA引物。将设计好的3对引物分别与lentiCRISPRv2载体连接构建重组质粒。慢病毒包装重组质粒,并感染人永生化的角质形成细胞株HaCaT细胞,嘌呤霉素筛选混合克隆。将混合克隆测序,挑选出发生基因组突变的混合克隆,并进行western blot实验,验证PD-L1的敲减效果。将得到的最优混合克隆,利用有限稀释法进行稀释,挑取单克隆,并用western blot实验验证单克隆的敲除效果。最后通过TA克隆的方法,检测敲除细胞中PD-L1的突变位点。结果:三组lentiCRISPRv2-gRNA重组质粒都构建成功。嘌呤霉素筛选出的混合克隆测序结果表明,仅Cas1、Cas2这两组重组质粒显示病毒感染有效,Cas3组无效。Western blot实验结果表明,Cas1组得到的混合克隆PD-L1敲减效果明显高于Cas2组。因此本研究选择Cas1组重组质粒感染细胞得到的混合克隆筛选单克隆。最后筛选得到3个单克隆,western blot实验验证发现这3个单克隆细胞PD-L1蛋白都无表达,即三个单克隆都为PD-L1敲除的阳性克隆。TA克隆结果表明,与野生型细胞相比,该细胞株两个染色体上存在不同缺失或插入,产生移码导致蛋白翻译终止只得到32个氨基酸的短肽。结论:本课题组成功构建了PD-L1基因敲除的人永生化角质形成细胞模型。第三章PD-L1敲除对角质形成细胞分泌细胞调节因子的影响目的:研究PD-L1敲除后,角质形成细胞分泌细胞调节因子(IL-1β、CXCL1、CXCL9、CCL20、S100A8、S100A9、IL-6和CXCL2)的变化,以确定PD-L1在表皮角质形成细胞中的作用。方法:通过实时定量PCR(polymerase chain reaction)及ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)实验,比较PD-L1敲除的角质形成细胞和阴性对照的角质形成细胞分泌促炎因子IL-1β、IL-6,趋化因子CXCL1、CXCL2、CXCL9、CCL20及抗菌肽类S100A8、S100A9表达的变化。同时,实时定量PCR方法检测两组细胞加入或不加入100 ng/ml IL-17A刺激24 h,分泌IL-1β、CCL20及S100A8的变化。结果:PD-L1敲除后,角质形成细胞分泌的IL-1β、CXCL1、CXCL9、CCL20、S100A8、S100A9都显著性上调,而IL-6、CXCL2的表达无显著性差异。IL-17A作用于对照组角质形成细胞24 h后,IL-1β、CCL20及S100A8的表达都显著增加;与对照组相比,PD-L1敲除细胞株中IL-17A的作用更明显,可导致IL-1β、CCL20及S100A8的表达增加更多。结论:PD-L1在角质形成细胞中不仅发挥直接的抑炎作用,并且可以抑制IL-17A介导的炎症反应。第四章角质形成细胞中PD-L1的调控目的:了解人表皮角质形成细胞PD-L1的调控因素,以便找到银屑病表皮角质形成细胞PD-L1下调的原因。方法:IFN-γ(25 ng/ml)、IL-17A(100 ng/ml)、IL-17F(100 ng/ml)、IL-1α(20 ng/ml)、IL-2(10 ng/ml)、IL-22(100 ng/ml)、IL-10(20 ng/ml)、TNF-α(20 ng/ml)分别刺激包皮来源的人原代表皮角质形成细胞24 h后,以实时定量PCR方法检测细胞PD-L1的mRNA表达,流式细胞术检测PD-L1蛋白表达。同时,还检测IFN-γ的浓度(25、50、100 ng/ml)及作用时间(0、3、6、12、24、48 h)对角质形成细胞PD-L1表达的影响。通过网络数据库的方法得到6个备选的miRNA,取其中4个miRNA(miR-16-5P、miR-15a-5P、miR-195-5P和miR-15b-5P)在人原代角质形成细胞中实施过表达研究,以实时定量PCR方法检测PD-L1 mRNA的表达、western blot实验分析PD-L1蛋白表达的变化。通过荧光探针原位杂交实验检测miR-15a-5P、miR-195-5P在银屑病患者皮损及健康人皮肤中的表达。结果:促炎因子中TNF-α、IFN-γ能上调人原代表皮角质形成细胞PD-L1的表达,且两者具有协同效应,其它细胞因子都无显著性作用。IFN-γ上调PD-L1的效果最明显,该上调效果随时间增加不断变强,作用3 h后PD-L1的表达量显著性上调,48 h后PD-L1的表达量到达峰值;IFN-γ浓度增高对PD-L1的表达无影响,25 ng/ml与100 ng/ml的上调效果基本相同。抑制性炎症因子IL-10对PD-L1的表达无调节作用。体外细胞实验表明,miR-15a-5P mimic与miR-195-5P mimic都能够显著下调人原代表皮角质形成细胞PD-L1的表达,miR-16-5P mimic和miR-15b-5P mimic都无此作用。荧光探针原位杂交实验结果表明,银屑病患者皮损角质形成细胞中miR-15a-5P的表达较健康人皮肤高,而miR-195-5P在两组角质形成细胞中的表达无显著性差异。结论:银屑病患者皮损处角质形成细胞PD-L1的下调与炎症因子刺激无关,可能与miR-15a-5P在皮损角质形成细胞中的过表达相关。第五章靛玉红通过PD-L1缓解银屑病小鼠的症状与炎症反应目的:通过前期的共表达网络分析,本研究发现靛玉红与表皮角质形成细胞PD-L1的表达呈现负相关,因此本章节拟考察靛玉红治疗银屑病的效应靶点是否包括PD-L1。方法:1、将24只8周龄的BALB/c小鼠随机分为3组:空白对照组、咪喹莫特(imiquimod,IMQ)诱导的银屑病样小鼠模型组、IMQ+靛玉红组。通过免疫荧光双染方法考察靛玉红干预后,模型组小鼠表皮角质形成细胞PD-L1表达的变化。2、将32只8周龄的BALB/c小鼠随机分为4组:空白对照组、IMQ模型组、IMQ+靛玉红组、IMQ+靛玉红+PD-L1抗体组。观察小鼠皮肤的表征变化,通过HE(hematoxylin-eosin)染色、实时定量PCR方法考察皮肤组织形态学变化、炎症因子(IL-1β、IL-23A、IL-17A、IL-22)分泌情况。3、将24只8周龄的BALB/c小鼠随机分为3组:IMQ模型组、IMQ+靛玉红组、IMQ+PD-L1 Fc组。观察小鼠皮肤的表征变化,通过HE染色、实时定量PCR、免疫荧光染色方法考察皮肤组织形态学变化、IL-17A表达及γδT细胞数量。4、以人原代表皮角质形成细胞为体外细胞模型,将细胞分为4组:对照组、miR-15a-5P组、靛玉红组、miR-15a-5P+靛玉红组,通过实时定量PCR方法考察PD-L1 mRNA表达的变化。结果:1、IMQ诱导的银屑病模型小鼠表皮角质形成细胞PD-L1的表达显著低于空白对照组小鼠。靛玉红干预组小鼠表皮角质形成细胞PD-L1的表达较IMQ模型组显著上调。2、靛玉红减轻银屑病模型小鼠红斑、增生等症状,减少表皮厚度、炎性细胞浸润,降低炎症因子(IL-1β、IL-23A、IL-17A、IL-22)分泌。然而,加入PD-L1抗体阻断后,靛玉红的治疗效果减弱,可见小鼠皮损症状加重,表皮厚度增加,炎性细胞浸润增加,且皮肤分泌的炎症因子表达也增加。3、靛玉红与PD-L1蛋白都能缓解IMQ诱导的小鼠银屑病样症状、降低表皮厚度、减少γδT细胞数量及IL-17A分泌。并且,两者相比较,靛玉红的疗效更好。4、miR-15a-5P下调人原代角质形成细胞PD-L1的表达,加入靛玉红后,miR-15a-5P的下调作用消失,PD-L1的表达恢复。结论:靛玉红为多靶点药物,可以通过调节表皮角质形成细胞PD-L1的表达缓解IMQ诱导的小鼠银屑病样症状与炎症反应。并且这种调节作用是通过影响miR-15a-5P途径发挥效用的。
【图文】：

银屑病,组织病理学

图 1D)、表皮突向真皮延伸、毛细血管扩张充血，并且表皮和真皮中伴有炎症细胞的浸润（图1B，1D）[6]。皮肤由表皮（包括角质层，颗粒层，棘层和基底层）、真皮（乳头层和网状层）及皮下组织组成。皮肤对外源物质刺激既提供了物理屏障，又提供了免疫屏障。表皮可以感知外界物质，通过最外层的角质层和紧密连接发挥物理屏障作用。皮肤的免疫屏障主要由表皮免疫微环境（epithelial immune microenvironment, EIME）决定[7]，而表皮免疫微环境位于表皮及真皮乳头层（图 2）。表皮的主要成分是角质形成细胞，在皮肤免疫应答中有着重要作用。它除了能够形成物理屏障外，还可以释放细胞内容物（DNA、RNA 及 ATP）及产生各种细胞调节因子（细胞因子，，趋化因子及脂质介质），是免疫应答的放大器。真皮乳头层位于表皮下方，由胶原纤维束组成，富含血管（末端微动脉，毛细血管和毛细血管后微静脉）和感觉神经末梢。真皮乳头层是免疫细胞和非免疫相互作用的区域。当皮肤的调节机制发生异常时，可引起EIME炎症的发生和扩展，进而导致易感人群发生炎症性皮肤病，比如银屑病。因此对皮肤EIM 的研究有利于了解银屑病的发病机制。

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图 2 表皮免疫微环境[7]Figure 2 Epithelial immune microenvironment银屑病的发病机制至今未能完全阐述清楚，目前公认的是其免疫学发病机 3）。由树突状细胞、T 淋巴细胞、中性粒细胞、角质形成细胞、血管内皮的具有复杂反馈回路的炎症反应循环。在银屑病发病的起始阶段, LL37 与死形成细胞 DNA/RNA 形成的复合物可以激活浆细胞来源的树突状细胞（p I 型干扰素（IFN- ，IFN-β）、IL-1、IL-6 和 TNF- 等炎症因子，I 型干扰-RNA 复合物可活化髓细胞来源的真皮树突状细胞（mDCs），从而释放 IL 这两个在银屑病中有着重要促炎作用的炎症因子。IL-12、IL-23 进一步诱导细胞活化，通过分泌产生 IFN-γ、IL-17A、IL-22 等细胞因子作用于真皮血胞与表皮角质形成细胞产生银屑病样的症状。目前对于银屑病免疫学作用机仅局限于 IL-17A、TNF- 、IL-23 等细胞因子与角质形成细胞的相互作用上制尚不明确，需要对其进行进一步探讨。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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