高通量筛选平台用于清热解毒中药的体内抗菌活性研究

发布时间：2020-04-10 09:12

【摘要】：目的:鲍曼不动杆菌近年来呈世界性流行趋势,已成为我国院内感染最重要的病原菌之一,尤其是广泛耐药鲍曼不动杆菌(Extensively drug resistant Acinetobacter baumannii,XDRAB),耐药性的快速传播和多重的耐药机制给临床治疗带来极大的困难,开发新型抗生素迫在眉睫。中药在中国感染性疾病的治疗中有着长期的应用,积累了丰富的经验,从清热解毒中药中寻找抗菌药效物质被认为是一条有效路径。线虫感染模型具有高通量、能全面反映药物体内活性等诸多优点,是抗菌药物筛选的理想实验模型。课题组前期研究初步建立了XDRAB-线虫感染模型,并将其用于抗菌活性中药的筛选,然而该模型尚不完善、筛选中药范围不够广泛。因此,本研究拟通过优化线虫感染模型的各项条件,提升模型的可靠性和稳定性;并基于该模型对多种清热解毒中药的抗菌活性进行评价,以发现具有体内抗菌活性的中药;在此基础上,进一步对活性中药主要成分的体内外抗菌活性进行评价,为研究和开发新型、高效的抗菌药物提供科学依据。方法:1.选用glp-4;sek-1双基因突变线虫,构建用于体内活性评价的XDRAB-C.elegans感染模型,通过观察线虫的存活率和生存状态,不断优化培养基组成、XDRAB的感染浓度、感染时长和药物的最佳干预时长等条件;2.2.1药材提取选取2010版《中国药典》一部中具清热解毒功效的73味中药,分别用水、50%乙醇、95%乙醇三种不同的溶剂,按1:10的物料比,通过回流提取的方法得到三种提取物,每次1小时,提取两次合并滤液后,在水浴锅上水浴干燥得到浸膏,于-20℃下保存备用。2.2活性评价将中药不同提取物稀释成五个梯度浓度(1000μg/mL、100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL),作用于感染模型,根据线虫存活率评价其体内抗菌活性。3.对筛选得到的具较好体内抗菌活性的提取物,采用线虫感染模型和微量肉汤稀释法,从多方面分析比较其主要成分的体内外抗菌活性。结果:1.在构建模型时,不同浓度的XDRAB和Fe~(3+)对线虫的致死情况不同,选择5×10~6 CFU/mL的XDRAB并加入10μmol的Fe~(3+)到20%BHI液体培养基中作为线虫感染的浓度。线虫生存实验显示,XDRAB感染线虫3 h后线虫组与加入多粘菌素B的对照组生存曲线比较,差异无统计学意义(χ~2=3.154,P0.05),感染线虫6、9 h,与对照组比较,差异均有统计学意义(均P0.001),但感染6 h与9 h组的生存曲线比较,差异无统计学意义(χ~2=0.669,P0.05),最终选择6h作为感染时长,36 h为合适的抗菌药物治疗时长。2.通过XDRAB-C.elegans模型对73味清热解毒中药提取物的体内抗菌活性进行评价,从中筛选得到具有显著体内抗菌活性的中药牡丹皮。3.对牡丹皮的四种主要活性成分丹皮酚、芍药苷、白桦脂酸、没食子酸的体内外抗菌活性进行评价,结果表明丹皮酚可以显著提升XDRAB感染线虫的生存率且无明显毒性作用;丹皮酚对XDRAB的MIC值为1024μg/mL,芍药苷的MIC值为2048μg/mL,没食子酸和白桦脂酸无抗XDRAB活性。结论:本研究通过进一步优化XDRAB-C.elegans感染模型,从73味清热解毒类中药中筛选出了具有显著体内抗菌活性的中药牡丹皮,并验证得到其主要活性成分丹皮酚在体内外均有明显抗XDRAB活性,为研究和开发新型、高效的抗菌药物提供科学依据。
【图文】：

线虫,存活状态,死亡状态,身体结构

- - - - - - - - - + + + 表示 XDRAB GZ-JZH-1;ATCC-25922 表示 E. coli ATCC25922“-”表示试管澄清透明，无菌。C. elegans 感染模型的优化培养基及 XDRAB 浓度对线虫感染模型的影响度的 XDRAB（5×108、5×107、5×106、5×105CFU/mL，的液体培养基（10 % BHI、20 % BHI）中感染秀丽隐态，确定合适的感染条件。在液体培养基中，存活线肉不停泵动，在光线和机械刺激时可以自由活动，而直线型僵直状态，有些身体过于肿胀而使得阴户突出线虫明显丧失身体结构（图 2-1），死线虫和活性具有定量计算。

秀丽隐杆线虫,生存曲线,对线

RAB 对线虫的感染影响，当加入 10 μM 的 Fe3＋后，，比不加 Fe3＋有对线虫的感明显的提高，但增加 Fe3＋浓度对线虫感染没有明显差异性，同时为了节省原最终选择加入 10μM Fe3＋进入 20 % BHI 液体培养基中增加 XDRAB 对线虫的力。通过考察不同浓度的 XDRAB 感染线虫的情况（图 2-3），发现在不同浓度RAB 感染下的半数致死时长（Time for half to die，LT50）明显不同，5×10/mL XDRAB 感染时 LT50为 12 h，5×107CFU/mL XDRAB 感染时 LT50为 18 h06CFU/mL XDRAB 感染时 LT50为 30h，在 5×105CFU/mL XDRAB 感染时 LT52 h。根据不同浓度 XDRAB 的致病力以及不同浓度 XDRAB 对试验进度的影模型最终选取 5×106CFU/mL XDRAB 作为感染浓度。在优化感染模型的过程中，以上感染条件有时候并不能重现，线虫有时还是感染致死。通过分析失败原因，我们推测是未充分清洗干净的 E. coli OP5曼相互作用干扰了鲍曼对线虫的感染，因此我们加入了最小抑菌浓度为 mL 的萘啶酸以抑制 E. coli OP50 的生长，得到了很好的效果，感染成功率几乎00 %。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285

【参考文献】