通腑养髓方对高铜诱导的SH-SY5Y细胞自噬效应及其作用机制的研究

发布时间：2020-04-10 08:47

【摘要】：Wilson’s病(WD)是一种由ATP7B基因突变引起的常染色体隐性遗传病,该基因突变可引起铜代谢障碍,导致铜在肝脏,脑等组织异常沉积,临床主要表现为肝硬化,神经/精神症状,运动障碍等。影像学研究提示脑型患者病变主要位于基底神经节,实验研究亦发现高铜可损伤小鼠黑质多巴胺能神经元,这些证据提示高铜诱导的多巴胺能神经元损伤是WD患者脑损伤的重要机制。因此,研究高铜诱导的多巴胺能神经元损伤机制及其可能的干预途径,是脑型WD患者治疗学研究的一个重要科学问题。铜在细胞内的大量蓄积可诱导氧化应激反应,增加活性氧(ROS)的释放,ROS在细胞内聚集可通过多途径诱导自噬发生。研究发现,铜-多巴胺络合物也可诱导大鼠多巴胺能神经元发生线粒体自噬。WD以金属络合剂为主的治疗方法因其毒副反应使许多患者不能耐受,严重影响了本病患者的病情和预后。本课题单位以清热解毒、通腑利湿治法治疗WD患者获得显著疗效,在此基础上加用活血养髓药物,以“通腑养髓”法治疗脑型WD患者,临床症状明显改善。前期研究发现通腑养髓方可下调TX小鼠脑内ASM、Cer、NK等蛋白的表达,从而改善TX小鼠的脑损伤症状。但这些研究尚不能完全阐明通腑养髓方对高铜诱导神经元损伤的具体疗效机制。高铜可诱导神经元自噬性死亡,因此我们假设通腑养髓方通过调控多巴胺能神经元自噬相关通路阻断高铜诱导的多巴胺能神经元损伤,从而发挥神经元保护作用,改善WD患者脑损伤症状。目的:研究通腑养髓方对高铜诱导的SH-SY5Y细胞自噬效应及其作用机制,为中医药防治脑型WD提供新的治疗靶点和研究思路。方法:(1)采用MTT法检测不同剂量CuSO_4作用SH-SY5Y细胞不同时间点对细胞存活率影响,筛选CuSO_4造模浓度及时间,模拟WD的细胞模型。(2)采用原子吸收法检测含通腑养髓方兔血清,及丁苯酞兔血清作用不同浓度、不同时间点,对模型SH-SY5Y细胞存活率的影响,筛选含药血清作用浓度及作用时间。(3)采用乳酸脱氢酶LDH释放实验检测细胞LDH漏出率。(4)采用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)探针法检测细胞内ROS的含量。(5)采用荧光染料JC-1检测细胞线粒体膜电位。(6)采用AO/EB染色法观察细胞内自噬空泡形成情况。(7)采用电镜法观察自噬体的形成。(8)采用MDC染色法对自噬进行定量分析。(9)采用Western Blot法检测Cyt-c的表达。(10)采用Western Blot法检测自噬相关蛋白LKB1、AMPK、p-AMPK、TSC2、LC3A/B、mTOR、P27、ULK1、p-ULK的表达。(11)采用Real-time PCR检测自噬相关基因LKB1、AMPK、TSC2、mTOR、P27、ULK1的表达。结果:(1)MTT结果显示:CuSO_4对SH-SY5Y细胞的损伤呈现一定的量效和时效关系(P0.01)。随着CuSO_4作用剂量及时间的增加,SH-SY5Y细胞的存活率呈现下降趋势(P0.01)。(2)MTT结果显示:与模型组对比,10%的含通腑养髓方兔血清及含丁苯酞兔血清可显著抑制CuSO_4诱导的细胞死亡(P0.01)。(3)MTT结果显示:CuSO_4作用细胞后LDH漏出率显著增加(P0.01),含通腑养髓方兔血清显著降低CuSO_4损伤SH-SY5Y细胞的LDH漏出率(P0.05),及含丁苯酞兔血清可显著降低CuSO_4损伤SH-SY5Y细胞的LDH漏出率(P0.01)。(4)DCFH-DA荧光染色发现CuSO_4可显著增加SH-SY5Y细胞内ROS生成(P0.01),含通腑养髓方兔血清及含丁苯酞兔血清可显著抑制CuSO_4诱导的细胞内ROS产生(P0.01)。(5)JC-1染色发现CuSO_4诱导SH-SY5Y细胞线粒体膜电位显著降低(P0.01),而含通腑养髓方兔血清及含丁苯酞兔血清呈剂量依赖性抑制CuSO_4诱导的线粒体膜电位降低(P0.05)。(6)AO/EB染色结果显示:正常组SH-SY5Y细胞形态正常,大部分胞核经AO染色后成呈现均匀的绿色。模型组大部分细胞核染色质呈现浓染固缩状态,细胞形态改变,且部分细胞呈现强烈的橘红色/红色荧光。含通腑养髓方兔血清及含丁苯酞兔血清作用后,仅出现少数被EB染成橘红色荧光的细胞,与正常细胞无显著差异。(7)透射电镜结果显示:正常组细胞内线粒体大小正常,形态完整,在细胞内的分布正常,自噬体的数量较少。与正常组对比,模型组细胞染色质凝聚,线粒体数目减少,线粒体结构紊乱且多空泡化,部分空泡内可见内容物,并有部分线粒体被包裹进囊泡里,自噬体较大,且数量明显增加。与模型组对比,通腑养髓方和丁苯酞细胞内未见明显空泡,细胞形态结构均接近于正常状态,且很难发现自噬体。(8)MDC染色结果显示:与正常组对比,模型组的荧光强度显著增加(P0.01),含通腑养髓方兔血清组和含丁苯酞兔血清组与模型组对比,荧光强度显著减弱(P0.01)。(9)Western blot结果显示:CuSO_4诱导Cyt-c的释放(P0.01),而含通腑养髓方兔血清组和含丁苯酞兔血清组呈剂量依赖性抑制CuSO_4诱导的Cyt-c的释放(P0.01)。(10)Western blot结果显示:与正常组对比,模型组细胞内LKB1、AMPK、p-AMPK、TSC2、LC3A/B、P27、ULK1蛋白的表达显著增加,mTOR、p-ULK蛋白的表达显著降低(P0.01)。与模型组对比,含通腑养髓方兔血清组和含丁苯酞兔血清组的LKB1、AMPK、p-AMPK、TSC2、LC3A/B、P27、ULK1蛋白表达显著降低,mTOR、p-ULK蛋白表达显著增加(P0.01)。(11)Real-time PCR实验结果显示:与正常组对比,模型组LKB1、AMPK、TSC2、P27、ULK1基因的表达显著增加,mTOR基因的表达显著降低(P0.01)。与模型组对比,含通腑养髓方兔血清组和含丁苯酞兔血清组LKB1、AMPK、TSC2、P27(P0.01)和ULK1(P0.05)基因的表达显著降低,mTOR基因表达显著增加(P0.01)。结论:高铜可通过诱导SH-SY5Y细胞内线粒体氧化应激,上调自噬相关蛋白及基因LKB1、AMPK、p-AMPK、TSC2、LC3A/B、P27及ULK1的表达,下调自噬相关蛋白及基因mTOR、p-ULK的表达,导致SH-SY5Y细胞发生自噬性死亡,而通腑养髓方可通过调控LKB1-AMPK信号通路,下调自噬相关蛋白及基因LKB1、AMPK、p-AMPK、TSC2、LC3A/B、P27、ULK1的表达,上调自噬相关蛋白及基因mTOR、p-ULK的表达,抑制自噬的发生,阻断高铜诱导的神经元损伤,从而发挥神经保护作用。
【图文】：

维生素A酸,显微镜观察,存活率,时效关系

图 1 显微镜观察维生素 A 酸对 SH-SY5Y 细胞的影响（n=3）（×400） The effect of vitamin Aacid on SH-SY5Y cells was observed by microscope（n=3）（×CuSO4造模浓度的筛选MTT结果显示：CuSO4对SH-SY5Y细胞的损伤呈现一定的量效和时效关系CuSO4作用剂量的增加及作用时间的延长，SH-SY5Y细胞存活率呈现下降P<0.01）。600μM CuSO4作用24h后，，存活率接近IC50，因此选择该浓度CSH-SY5Y细胞24h造模浓度（见图2）。

浓度,存活率,细胞

存活率接近IC50，因此选择该浓度CuSO4作为SH-SY5Y细胞24h造模浓度（见图2）。图 2 不同剂量 CuSO4作用于 SH-SY5Y 细胞不同时间（n=6）Fig.2 The different concentration of copper act on SH-SY5Y cells at different times (n=6)(#P <0.05,##P<0.01, compared with control group; *P<0.05, **P<0.01, compared with model group;n=6)
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】