乳香挥发油及地塞米松对IL-1β介导的兔视网膜色素上皮细胞迁移、增殖及NF-κB信号通路的影响

发布时间：2020-04-10 12:03

【摘要】：目的观察不同浓度IL-1β对兔视网膜色素上皮细胞增殖的影响,并研究不同浓度乳香挥发油及地塞米松对IL-1β介导的兔视网膜色素上皮细胞增殖、迁移的抑制作用及其对NF-κB信号通路的影响,从而探讨乳香挥发油及地塞米松的抗炎作用及其分子机制。方法1.采用MTT法检测不同剂量IL-1β作用于兔RPE细胞24h、48h、72h后对兔RPE细胞增殖的影响,并筛选最佳干预浓度、时间;同时采用MTT法检测不同浓度乳香挥发油(0.15mg/mL、0.3mg/mL、0.45mg/mL、0.6mg/mL、0.75mg/mL)及阳性对照药物地塞米松(50 mg/L、100 mg/L、200 mg/mL、400 mg/L、600 mg/L)对IL-1β介导的兔RPE细胞增殖的影响。采用流式细胞仪检测不同浓度乳香挥发油及地塞米松对IL-1β介导的细胞凋亡的影响。根据MTT检测结果及凋亡率检测结果筛选乳香挥发油低、中、高浓度组(0.15mg/mL、0.3mg/mL、0.6mg/mL)及阳性对照药物地塞米松低、中、高浓度组(50mg/L、100mg/L、400mg/L)。采用流式细胞仪检测低、中、高浓度乳香挥发油及地塞米松对IL-1β作用下细胞增殖周期的影响。划痕实验观察低、中、高浓度乳香挥发油及地塞米松对IL-1β介导的细胞迁移的影响。采用蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测低、中、高浓度乳香挥发油及地塞米松对IL-1β作用下兔RPE细胞中NF-κBp65、p-IκBα、COX-2蛋白表达量的影响。免疫细胞化学染色法观察乳香挥发油对IL-1β作用下兔RPE细胞NF-κBp65、p-IκBα、COX-2蛋白表达的影响。结果1.MTT法检测不同浓度IL-1β干预24h、48h、72h对兔RPE细胞增殖的影响同时相内不同处理组之间比较:与无血清DMEM组比较,各时相内各IL-1β组细胞存活率均显著增大,尤以浓度为10g/L时最为明显(P0.01),当浓度小于10g/L时,IL-1β对兔RPE细胞的促增殖作用具有浓度依赖性,24h时相内,除外20g/L IL-1β、30g/L IL-1β组,其他各组与无血清DMEM组比较差异均具有统计学意义(P0.05或P0.01);48h时相,各浓度组IL-1β与无血清DMEM组差异均具有统计学意义(P0.05或P0.01);72h时相,各浓度组IL-1β与无血清DMEM组差异均具有统计学意义(P0.01)。同一处理组内不同时相之间比较:各处理组细胞存活率均随时间延长有所增加,即IL-1β对兔RPE细胞的促增殖作用具有时间依赖性,综合以上,选取浓度为10g/L的IL-1β干预兔RPE细胞进行后续实验。2.MTT法检测不同浓度乳香挥发油及地塞米松干预24h对IL-1β作用下的兔RPE细胞存活率的影响10g/L IL-1β对照组与无血清DMEM组比较显著促进兔RPE细胞增殖,差异具有统计学意义(P0.01),除外0.2%DMSO溶媒对照组(P0.05),其他各处理组与IL-1β组比较均显著抑制兔RPE细胞增殖,差异均具有统计学意义(P0.01),且随着浓度增大,乳香挥发油及地塞米松对细胞增殖抑制能力越显著,具有浓度依赖性。0.3mg/mL乳香挥发油组与100mg/L地塞米松组比较无明显差异(P0.05)。3.Annexin-VFITC/PI复染FCM检测不同浓度乳香挥发油及地塞米松干预24h对IL-1β作用下的兔RPE细胞凋亡率的影响早期凋亡率比较:10g/L IL-1β对照组与无血清DMEM组比较其早期凋亡率明显下降,差异具有统计学意义(P0.01),除外0.2%DMSO溶媒对照组及50mg/L地塞米松(P0.05),其他各处理组与IL-1β组比较早期凋亡率均明显增加,差异具有统计学意义(P0.05或P0.01),且随着浓度增大,乳香挥发油及地塞米松处理细胞后其早期凋亡率逐渐增大,具有浓度依赖性,0.3mg/mL乳香挥发油组与100mg/L地塞米松组比较早期凋亡率较高,差异具有统计学意义(P0.01)。晚期凋亡率比较:10g/L IL-1β对照组与无血清DMEM组比较其晚期凋亡率明显下降,差异具有统计学意义(P0.01),除外0.2%DMSO溶媒对照组(P0.05),其他各处理组与IL-1β组比较晚期凋亡率明显增加,差异均具有统计学意义(P0.01),且随着浓度增大,乳香挥发油及地塞米松处理细胞后其晚期凋亡率逐渐增大,具有浓度依赖性,0.3mg/mL乳香挥发油组与100mg/L地塞米松组比较晚期凋亡率较低,差异具有统计学意义(P0.01)。4.PI染色检测不同浓度乳香挥发油及地塞米松干预24h对IL-1β作用下的兔RPE细胞增殖周期的影响10g/L IL-1β对照组与无血清DMEM组比较其G_1/G_0期细胞数比例明显减少,S期及G_2/M期细胞比例明显增多,差异具有统计学意义(P0.01),说明IL-1β通过诱导G_1/G_0期细胞向S期及G_2/M期转化从而促进兔RPE细胞增殖,除外0.2%DMSO溶媒对照组(P0.05),其他各处理组与IL-1β组比较G_1/G_0期细胞数比例均明显增加,差异均具有统计学意义(P0.01),且随着浓度增大,乳香挥发油及地塞米松各浓度组处理细胞后其G_1/G_0期细胞数逐渐增多,具有浓度依赖性,而各处理组与IL-1β组比较S期及G_2/M期细胞数随浓度增加其比例逐渐减少,除外高浓度乳香挥发油组S期与IL-1β组比较无明显差异(P0.05),其他各组S期及G_2/M期与IL-1β组比较差异均具有统计学意义(P0.05或P0.01),中浓度乳香挥发油组与中浓度地塞米松组比较其G1/G0期细胞较少、S及G2/M期细胞较多,差异具有统计学意义(P0.01),说明乳香挥发油及地塞米松将IL-1β作用后的兔RPE细胞阻滞于G_1/G_0期减缓细胞进入增殖周期,抑制细胞分裂增殖,从而促进细胞凋亡,且乳香挥发油作用优于地塞米松。5.划痕实验检测不同浓度乳香挥发油及地塞米松干预24h、48h对IL-1β作用下的兔RPE细胞迁移的影响10g/L IL-1β对照组与无血清DMEM组24h及48h比较其迁移愈合率明显增大,差异具有统计学意义(P0.01),说明10g/L IL-1β能明显促进兔RPE细胞的损伤愈合,促进其迁移。除外0.2%DMSO溶媒对照组(P0.05),其他各处理组与IL-1β组比较其迁移愈合率均明显减少,差异均具有统计学意义(P0.01),且随着浓度增大,乳香挥发油各浓度组及地塞米松各浓度组处理细胞后迁移愈合率逐渐降低,具有浓度依赖性。24h中浓度乳香挥发油组与中浓度地塞米松组比较其迁移率较高,差异具有统计学意义(P0.05),48h中浓度乳香挥发油组与地塞米松组比较其迁移率较低,差异具有统计学意义(P0.01)。6.Western blot法检测各组细胞中NF-κBp65在胞浆蛋白及核蛋白中的表达量,并计算核转位率空白对照组NF-κBp65蛋白在胞浆及核中均有少量表达,溶媒对照组与其比较无明显差异(P0.05)。10g/L IL-1β对照组与空白对照组比较,胞浆内蛋白表达量减少,细胞核内蛋白表达量明显增多,核转位率显著提高,差异具有统计学意义(P0.01),表明10g/L IL-1β能明显促进NF-κBp65蛋白从胞浆向核内转移。而乳香挥发油及地塞米松高、中、低处理组与IL-1β组比较核转位率明显降低,差异均具有统计学意义(P0.01),且随着浓度增大,乳香挥发油各浓度组及地塞米松各浓度组处理细胞后其核转位率逐渐减小,具有浓度依赖性。中浓度乳香挥发油组与中浓度地塞米松组比较其核转位率较高,差异具有统计学意义(P0.01)。7.Western blot法检测各组细胞中p-IκBα在胞浆蛋白中的表达量及COX-2在总蛋白中的表达量无血清DMEM组p-IκBα蛋白在胞浆中以及COX-2在总蛋白中均有少量表达,溶媒对照组与其比较无明显差异(P0.05)。10g/L IL-1β对照组与无血清DMEM组比较,p-IκBα、COX-2蛋白表达明显增加,差异均具有统计学意义(P0.01),表明10g/L IL-1β能明显提高p-IκBα、COX-2蛋白表达量。除外乳香挥发油低浓度组中COX-2蛋白表达与IL-1β组比较无明显差异(P0.05),其他各处理组及地塞米松高、中、低浓度组与IL-1β组比较则明显抑制p-IκBα、COX-2蛋白表达,差异均具有统计学意义(P0.01),且随着浓度增大,乳香挥发油各浓度组及地塞米松各浓度组处理细胞后蛋白表达量逐渐下降,具有浓度依赖性。中浓度乳香挥发油组与中浓度地塞米松组比较p-IκBα、COX-2蛋白在胞浆及总蛋白中的表达量均较高,差异具有统计学意义(P0.01或P0.05)。8.免疫细胞化学染色法检测兔RPE细胞NF-κBp65、p-IκBα、COX-2蛋白表达的影响NF-κBp65:空白对照组NF-κBp65在胞浆及核中均有少量表达,呈弱阳性,且胞浆中的表达量较多,10g/L IL-1β对照组与无血清DMEM组比较,NF-κBp65表达量明显增多,胞浆及核内均有表达,且有些细胞核内NF-κBp65表达量较胞浆内多,差异均具有统计学意义(P0.01),溶媒对照组与IL-1β对照组比较无明显差异(P0.05)。而乳香挥发油及地塞米松高、中、低处理组与IL-1β组比较NF-κBp65表达量明显减少,差异均具有统计学意义(P0.01),且随着浓度增大,乳香挥发油各浓度组及地塞米松各浓度组处理细胞后其NF-κBp65表达量逐渐减小,具有浓度依赖性。中浓度乳香挥发油组与中浓度地塞米松组比较表达量较高具有统计学意义(P0.01)。p-IκBα:空白对照组p-IκBα在胞浆及核中均有少量表达,且胞浆中的表达量较多,10g/L IL-1β对照组与空白对照组比较,胞浆内p-IκBα表达量明显增多,呈强阳性,差异均具有统计学意义(P0.01),溶媒对照组与IL-1β对照组比较无明显差异(P0.05)。而乳香挥发油及地塞米松高、中、低处理组与IL-1β组比较p-IκBα表达量明显减少,差异均具有统计学意义(P0.01),且随着浓度增大,乳香挥发油各浓度组及地塞米松各浓度组处理细胞后其p-IκBα表达量逐渐减小,具有浓度依赖性。中浓度乳香挥发油组与中浓度地塞米松组比较表达量较高,差异具有统计学意义(P0.01)。COX-2:空白对照组COX-2在细胞中有少量表达,呈弱阳性,10g/L IL-1β对照组与空白对照组比较,胞浆内表达量明显增多,呈强阳性,差异均具有统计学意义(P0.01),溶媒对照组与IL-1β对照组比较无明显差异(P0.05)。而乳香挥发油及地塞米松高、中、低处理组与IL-1β组比较COX-2表达明显减少,差异均具有统计学意义(P0.01),且随着浓度增大,乳香挥发油各浓度组及地塞米松各浓度组处理细胞后其COX-2表达量逐渐减小,具有浓度依赖性。中浓度乳香挥发油组与中浓度地塞米松组比较表达量无统计学意义(P0.05)。结论1.IL-1β可明显促进兔RPE细胞增殖,其中浓度为10g/L时促增殖作用最为明显,当其浓度小于10g/L时,对兔RPE细胞的促增殖作用具有剂量、时间依赖性。2.乳香挥发油及地塞米松干预24h可显著抑制IL-1β介导的兔RPE细胞增殖,且随着浓度增大,抑制作用越显著。3.乳香挥发油及地塞米松干预24h可显著提高IL-1β介导的兔RPE细胞的早期及晚期凋亡率,且随着浓度增大,凋亡率呈增高趋势。4.IL-1β通过诱导G_1/G_0期细胞向S期及G_2/M期转化从而促进兔RPE细胞增殖,乳香挥发油及地塞米松将IL-1β作用后的兔RPE细胞阻滞于G1/G0期减缓细胞进入增殖周期,抑制细胞分裂增殖,从而促进细胞凋亡,呈浓度依赖性,且乳香挥发油作用优于地塞米松。5.乳香挥发油及地塞米松均能明显抑制IL-1β介导的兔RPE细胞迁移,且随着浓度增大,其迁移愈合率呈降低趋势。6.乳香挥发油及地塞米松均可有效抑制IL-1β干预后所致的NF-κBp65核转移,及p-IκBα、COX-2蛋白表达量增加,且随着浓度增大,抑制作用越明显。
【图文】：

注：A:空白对照组,B:IL-1β对照组,C:溶媒对照组,D:低剂量乳香挥发油组,E:中剂量乳香挥发油组,F:高剂量乳香挥发油组,G:低剂量地塞米松组,H:中剂量地塞米松组,I:高剂量地塞米松组图 2 PI 染色检测乳香挥发油及地塞米松对 IL-1β作用下的兔 RPE 细胞增殖周期的影响5.划痕实验检测不同浓度乳香挥发油及地塞米松干预 24h、48h 对 IL-1β 作用下的兔 RPE细胞迁移的影响10g/L IL-1β 对照组与无血清 DMEM 组 24h 及 48h 比较其迁移愈合率明显增大，差异具有统计学意义（P<0.01），说明 10g/L IL-1β 能明显促进兔 RPE 细胞的损伤愈合，促进其迁移。除外 0.2%DMSO 溶媒对照组（P>0.05），其他各处理组与 IL-1β 组比较其迁移愈合率均明显减少，差异均具有统计学意义（P<0.01），且随着浓度增大，乳香挥发油各浓度组及地塞米松各浓度组处理细胞后迁移愈合率逐渐降低，具有浓度依赖性，说明乳香挥发油及地塞米松均能明显抑制 IL-1β 介导的兔 RPE 细胞迁移。各浓度组间两

注：A:空白对照组,B:溶媒对照组,C:IL-1β对照组,D:低剂量乳香挥发油组,E:中剂量乳香挥发油组,F:高剂量乳香挥发油组,G:低剂量地塞米松组,H:中剂量地塞米松组,I:高剂量地塞米松组图 5 免疫细胞化学染色法检测兔 RPE 细胞 NF-κBp65 蛋白表达53
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285

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本文编号：2622202