产α-淀粉酶抑制剂罗汉果内生菌的筛选及其活性成分研究

发布时间：2020-04-10 18:21

【摘要】：α-淀粉酶抑制剂(α-amylase inhibitor,α-AI)属于糖苷水解酶抑制剂的一种,广泛存在于各种植物种子、胚乳和微生物代谢产物中。α-淀粉酶抑制剂可特异性地抑制α-淀粉酶发生水解作用,阻碍食物中碳水化合物的水解,从而减少人体对糖分的摄取,可降低血糖、血脂指标,因此,可以作为防止和治疗肥胖症、脂肪过多症、动脉硬化症、高血脂及糖尿病等疾病的有效药物。罗汉果内生菌(endophyticbacteria)普遍存在于健康罗汉果植物组织中,是植物微生态系统的重要组成部分。大量研究表明内生菌可产生与寄主相同或功能相似的活性物质。罗汉果内含有可显著降低血糖的活性物质,其降糖活性可能通过基因插入或转换到内生菌中,使内生菌具有与宿主相同或相似的降糖功能。因此,罗汉果内生菌可作为降糖活性物质(α-淀粉酶抑制剂)的筛选来源,且具有很大的潜力与开发价值。本研究从罗汉果内生菌中筛选出能高产α-淀粉酶抑制剂的内生真菌,从菌株的发酵产物中分离纯化出α-淀粉酶抑制剂,对其理化性质进行研究,并对菌株的发酵条件进行优化增加目标产物的得率,目的是为α-淀粉酶抑制剂开发为降糖、减肥药物或保健食品等的工业化生产奠定基础。同时为罗汉果内生菌的其他开发利用提供理论依据,主要完成内容如下:1.罗汉果内生菌的分离采用不同的表面消毒方案分别从罗汉果根、茎、叶和果实中分离得到内生真菌各33、10、3、30株和内生细菌各18、5、3、10株。2.产α-淀粉酶抑制剂罗汉果内生真菌的筛选采用打洞法和Bernfeld法筛选得到11株具有α-淀粉酶抑制活性的罗汉果内生真菌,其中编号为PD-3、PD-4、P-3、P-8的4株内生菌0.25 mL发酵原液对α-淀粉酶抑制率分别为47.96%、88.43%、57.74%和73.67%,抑制活性均高于1 mg·mL~(-1)的阳性对照阿卡波糖(45.78%),对4株菌株进行活性部位追踪得到它们的有效活性部位分别为乙酸乙酯相(PD-4、P-3、P-8)和正丁醇相(PD-3),抑制率测定结果显示,菌株PD-4的乙酸乙酯相活性最高,当有效相浓缩浸膏质量浓度为1mg·mL~(-1)时抑制率高达99.46%,相当于浓度为2.079mg·mL~(-1)阿卡波糖的抑制活性。对4株菌株有效相进行化学成分分析研究发现具有α-淀粉酶抑制活性的成分可能为蛋白质、多糖、有机酸类、黄酮类、酚类和醌类等化学成分。3.菌株PD-4产α-淀粉酶抑制剂发酵条件优化及分子生物学鉴定从五种不同的发酵培养基筛选出PDB培养基作为菌株PD-4进行发酵条件优化的基础培养基。采用单因素实验探讨不同温度、装液量、接种量、初始pH值和发酵时间等对菌株产α-淀粉酶抑制剂的影响,最终选取温度、初始pH值、装液量和发酵时间等四个因素进行正交实验优化。结果表明,发酵培养基初始pH值对菌株PD-4产α-淀粉酶抑制剂影响最显著,最佳的发酵条件组合为发酵培养基初始pH值为7,装液量为200 mL(三角瓶容量500 mL),30℃条件下发酵培养8 d。最终通过正交实验结果证实发酵液(0.25 mL)对α-淀粉酶抑制率为89.84%,较优化前提高了1.41%。对菌株PD-4进行形态学鉴定,发现菌株菌落正面为灰绿色,表面粗糙,由中间往外成环状延伸生长;菌落背面呈淡黄色。显微镜观察菌丝体无隔,菌丝顶部有分生孢子梗,孢子灰绿色呈卵圆形。为进一步确定菌株PD-4的种属,采用分子生物学手段对其进行测定,结果表明:菌株PD-4与Penicillium rolfsii属有99%的相似性,为罗尔夫青霉。4.α-淀粉酶抑制剂活性成分的纯化研究将菌株PD-4大量发酵,发酵液经极性由小到大的有机溶剂萃取后得到活性最高的乙酸乙酯相。通过大孔吸附树脂和硅胶柱层析纯化后,得到的纯化物样品浸膏在质量浓度为0.3 mg·mL~(-1)时抑制率为87.18%,相当于1.904 mg·mL~(-1)阿卡波糖的抑制率。通过对其理化性质研究发现,温度和pH值对α-淀粉酶抑制剂的活性影响不大;而金属离子的影响则随着Na~+和Ca~(2+)离子浓度的升高,抑制率逐渐降低,Fe~(3+)和Mg~(2+)对抑制剂活性基本无影响,低浓度K~+(0.01 mg·mL~(-1))对抑制剂活性影响不大,浓度为0.5 mg·mL~(-1)时活性有所降低。经HPLC检测发现,纯化物样品在250 nm波长下,于20 min时有一单峰出现,而得到的纯化物仍有少许杂质存在,无法进行结构鉴定,有待进一步纯化。经化学成分分析初步确定其为黄酮类物质。
【图文】：

菌株,阿卡波糖,α-淀粉酶,抑制活性

图 3-1 产 α-淀粉酶抑制剂菌株打洞法筛选结果of strain strain producing alpha-amylase inhibi知，菌株 PD-4 和 P-8 透明圈最小，几乎阳性对照的阿卡波糖要小，说明这四种菌 Bernfeld 法筛选结果法筛选出的 11 种罗汉果内生真菌进行抑，菌株 PD-4 发酵液对 α-淀粉酶抑制活性7%，，菌株P-3与 PD-3 抑制活性也较高，分α-淀粉酶抑制率均比阳性对照阿卡波糖高结果选取该四种菌株进行后续进一步的

细胞结构,菌落,α-淀粉酶,菌丝体

22图 3-2 产 α-淀粉酶抑制剂活性菌株形态观察结果菌落及细胞结构图-2 Fungui colony and cell structure of active strain producing alpha-amylase inhibitoobserved性菌株菌丝体 α-淀粉酶抑制活性测定 3-3 可知，与阴性对照相比，菌株 PD-3、PD-4、P-3 与 P-8 的菌丝体水 α-淀粉酶无抑制活性。对比 3.3.2 说明活性存在于发酵液中。
【学位授予单位】：广西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284

【参考文献】