Sennoside A影响肠道微生物的组成平衡损伤结肠黏膜屏障促进结肠癌发展

发布时间：2020-04-11 06:27

【摘要】：[研究背景与目的]大黄及含大黄的中药复方及保健品使用广泛,但其安全性长期备受争议。蒽醌类化合物作为大黄最主要的药效物质,其潜在的促炎致癌风险受到学术界的高度重视。既往研究,有着零星的实验数据指出来大黄蒽醌类化合物对于结肠上皮组织的结构造成损伤,前瞻性研究数据也指出长期蒽醌类轻泻剂的使用与结肠癌发生发展具有一定的相关性。但是现有碎片化的信息不能正面回答大黄蒽醌类化合物是否促癌?本研究直面这一科学困惑,以大黄蒽醌类化合物中最主要的泻下成分——Sennoside A(番泻苷A)为主要研究对象。通过评价Sennoside A的直接作用,探讨其是否直接促炎致癌?并结合经典的化学诱导两阶段AOM/DSS结肠癌模型评价Sennoside A可能的促癌作用。近年来,随着肠道微生物研究手段的发展,肠道微生物与结肠炎结肠癌发生发展的相关性被不断证实。其中,肠黏膜屏障的完整性的破坏是肠道微生物影响结肠炎及结肠癌发生发展的关键始动。前期关于大黄尤其是结合型蒽醌-Sennoside A泻下的机制表明肠道微生物在其中扮演着不容忽略的作用,其需要通过肠道微生物分泌的β-葡萄糖苷酶水解才可发挥泻下的作用。这提示我们,SennosideA在体内不可避免的与肠腔内微生物群相互作用。那么,Sennoside A的促炎致癌风险是否与之密切相关呢?本研究以肠黏膜屏障的完整性为切入点,着眼于肠道微生物所扮演的角色,旨在阐明Sennoside A是否破坏结肠上皮屏障的完整性促进结肠炎及结肠癌的发生发展?为明确大黄蒽醌类化合物可能具有的促炎致癌风险的潜在毒性物质基础的确定提供一定的依据。[研究内容]本研究首次从肠黏膜屏障完整性角度出发,评价了 Sennoside A对于结肠黏膜屏障的两大物理屏障—机械屏障及粘液屏障进行观察。第三部分重点检测并分析了 Sennoside A对肠道微生物菌群结构的影响,发现Sennoside A长期处理组的biomarker,即为Sennoside A促进其优势生长的菌群。第四部分关注了 Sennoside A可显著抑制其生长的菌群及其所引起结肠病理学改变。基于以上,进一步通过粪菌移植实验确证Sennoside A所造成肠黏膜屏障的损伤过程,肠道微生物的结构紊乱扮演着不容忽视的角色。第六部分与第七部分,本研究以肠黏膜屏障完整性损伤出发,进一步评价了 Sennoside A可造成结肠低水平炎症以及代谢紊乱,并促进AOM/DSS模型的结肠癌发生。[研究结果]第二部分首先对结肠机械屏障的完整性进行考察,研究发现长期(84天)给予Sennoside A可剂量依赖性的促进结肠隐窝结构及形态的改变,表现为降低隐窝杯状细胞数目,减少杯状细胞分泌粘液,导致结肠隐窝萎缩,使得淋巴细胞侵入隐窝腔内。同时,促进紧密连接蛋白(ZO-1,Claudin-1)及粘附蛋白(E-cadherin)在结肠上皮组织的表达与分布,体外实验证实Sennoside A对机械屏障的损伤并不通过直接作用于结肠上皮细胞而发挥的。同时,阿尔新蓝染色结果显示Sennoside A剂量依赖性抑制隐窝杯状细胞粘液分泌,破坏了内层黏液层对肠上皮层的覆盖。免疫荧光对构成结肠内层黏液层的最主要的黏蛋白-MUC2进行观察,结果与阿尔新蓝染色结果一致,且显著影响了MUC2黏蛋白的合成。鉴于,Sennoside A对结肠物理屏障的损伤,进一步结肠黏膜的屏障功能进行评价。通过可视,整体,客观的评价手段发现Sennoside A增加了结肠屏障的通透性促进了肠腔内细菌移位至结肠上皮组织。第三部分,通过16srDNA测序分析,发现了Sennoside A对于肠道微生物的α-多样性(Shannon index)无显著改变,这从一定层面上说明Sennoside A并不影响肠道菌群的整体物种结构的多样性。但是,却显著影响了肠道微生物的β-多样性。门水平的相对丰度分析显示Sennoside A显著促进Verrucomicrobia菌门的优势丰度,且显著抑制厚壁菌门的相对丰度。Lefse分析发现A.muciniphila是Sennoside(100mg/kg)组的标志性biomarker。进一步利用绝对定量PCR对A.muciniphila在盲肠内容物中的含量进行确证,结果也显示,与Ctrl组相比,Sennoside A显著促进A.muciniphil 的含量。然而,Sennoside A使用早期,对A.muciniphil 的相对丰度没有显著影响,而是在连续灌胃56天开始显示了显著的促生长作用。确定了 Sennoside A对于Akkermansia muciniphila优势生长的促进是一个动态增加的过程。体外菌群培养以确定Sennoside A原形,Sennoside A微生物代谢混合物以及主要代谢产物Rhein对于A.muciniphil 的生长均无显著影响,说明Sennoside A对A.muciniphila的生长优势的促进并不是直接作用。第四部分进一步分析发现 Sennoside A 对于几种产短链脂肪酸菌属(Coprcoccus,Prevotella,Oscillospira,Ruminococcus)的抑制作用。同时,基于order水平发现了Clostridiales相对丰度显著下降,体外对两个主要的产丁酸菌(Clostridium tyrobutyrate和Clostridium butyricum 体外Sennoside A的直接抑菌作用进行考察,说明肠道内的Sennoside A可直接抑制C tyrobutyrate和C.butyricum的生长,但不是通过Sennoside A原形发挥抑制作用,而是通过其肠内代谢物尤其是Rhein产生的直接抑菌作用。进一步针对其短链脂肪酸水平进行检测。GC-MS检测我们发SennosideA组短链脂肪酸中的乙酸、丙酸并未发生显著改变,而丁酸水平明显降低。Luminex实验结果显示SennosideA能够诱导IL-17、IFN-γ、MIP-2等多种促炎因子水平升高。并促进Th1以及Th17细胞数量增多,并可导致结肠隐窝上皮细胞的增殖增加。而以上由Sennoside A造成丁酸水平降低所引起的炎性改变可被丁酸补充所逆转。第五部分利用粪菌移植手段,从Sennoside A促进的A.muciniphil 主要影响的肠道黏膜屏障的角度,确证了肠道微生物对于Sennoside A造成肠黏膜屏障完整性的不容忽视的关键作用。基于以上对Sennoside A可造成肠黏膜屏障完整性损伤的确证,进一步评价所造成的黏膜屏障的损伤是否会产生促炎促癌作用。第六部分研究发现100mg/kg Sennoside A长期给药会导致粪便中低水平炎症marker LCN2水平的急剧升高。与此同时,Sennoside A显著增加了TNF-α、IL-1β、IL-6促炎因子基因的表达水平,降低了IL-10抑炎因子的表达水平,提示Sennoside A诱导结肠组织促炎信号通路的激活。代谢组学研究发现Sen能够引起机体代谢的异常,包括嘌呤代谢、嘧啶代谢以及多种氨基酸代谢等。当前研究认为,长期的低水平炎症会促进肿瘤的发生发展。第七部分研究表明,Sennoside A可促进结肠癌的发展,表现为腺瘤出现时间早于AOM/DSS组,且伴随着STAT3信号通路以及β-catenin信号通路更为强烈的激活,腺瘤附近上皮细胞的增殖增加,提示着可能产生的恶性转变。[结论与意义]本研究确证了大黄结合型蒽醌代表性化合物—Sennoside A可通过破坏肠黏膜屏障完整性引起结肠长期低水平炎症且促进结肠癌的发展。发现Sennoside A可促进A.muciniphila的优势生长以及产丁酸菌群的生长抑制,明确了 Sennoside A损伤肠黏膜屏障完整性与其所引起的粘液降解菌—外源性纤维降解菌的平衡破坏密切相关。基于一系列实验结果及相关讨论,可以确证Sennoside A是大黄蒽醌类化合物促炎致癌风险的毒性物质基础,为大黄蒽醌类化合物使用规避促炎致癌风险提供坚实的实验依据。
【图文】：

腺瘤,长期使用,结肠,结肠癌

是否具有致癌作用。结肠癌的发生发展是结肠正常上皮黏膜向结肠腺瘤转变的累积过程，逡逑经历“正常—低度不典型增生高度不典型增生—结肠腺瘤—结肠癌”的演变过程。结肠腺逡逑瘤的产生是发生结肠癌的前提。如图２－１Ａ所示连续给予ＳｅｎｎｏｓｉｄｅＡ邋（２５，５０，１００ｍｇ／ｋｇ）邋８４逡逑天小鼠结肠未见可见腺瘤的产生。此外，长期慢性结肠炎症的持续刺激是结肠癌发生关键逡逑诱因，进一步对结肠组织的病理状态进行评价。如图２－１Ｂ所示，Ｓｅｎｎｏｓｉｄｅ邋Ａ长期使用并逡逑不导致结肠活动性炎症，结肠黏膜层未见大量淋巴细胞浸润，未见异型（不典型）增生，逡逑未见组织溃疡。逡逑Ａ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ｓｅｎ邋Ａ邋（１００ｍｇ／ｋｇ）邋Ｓｅｎ邋Ａ邋（５０ｍｇ／ｋｇ）邋Ｓｅｎ邋Ａ邋（２５ｍｇ／ｋｇ）逡逑■■Ｉ逡逑：ｌｉ邋ｎ邋：｜１邋ｕ邋：邋＾邋ｕ邋ｉ邋＾邋ｕ逡逑＿邋．、，之逦＾逡逑图２－１邋Ｓｅｎｎｏｓｉｄｅ邋Ａ不直接促进结肠可见腺瘤的形成逡逑Ａ．邋ＳｅｎｎｏｓｉｄｅＡ不同剂量（２５，５０，１００ｍｇ／ｋｇ）长期使用未见可见腺瘤的形成；Ｂ．邋ＳｅｎｎｏｓｉｄｅＡ逡逑不同剂量长期使用

隐窝,黏膜,杯状细胞,结肠

是否具有致癌作用。结肠癌的发生发展是结肠正常上皮黏膜向结肠腺瘤转变的累积过程，逡逑经历“正常—低度不典型增生高度不典型增生—结肠腺瘤—结肠癌”的演变过程。结肠腺逡逑瘤的产生是发生结肠癌的前提。如图２－１Ａ所示连续给予ＳｅｎｎｏｓｉｄｅＡ邋（２５，５０，１００ｍｇ／ｋｇ）邋８４逡逑天小鼠结肠未见可见腺瘤的产生。此外，长期慢性结肠炎症的持续刺激是结肠癌发生关键逡逑诱因，，进一步对结肠组织的病理状态进行评价。如图２－１Ｂ所示，Ｓｅｎｎｏｓｉｄｅ邋Ａ长期使用并逡逑不导致结肠活动性炎症，结肠黏膜层未见大量淋巴细胞浸润，未见异型（不典型）增生，逡逑未见组织溃疡。逡逑Ａ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ｓｅｎ邋Ａ邋（１００ｍｇ／ｋｇ）邋Ｓｅｎ邋Ａ邋（５０ｍｇ／ｋｇ）邋Ｓｅｎ邋Ａ邋（２５ｍｇ／ｋｇ）逡逑■■Ｉ逡逑：ｌｉ邋ｎ邋：｜１邋ｕ邋：邋＾邋ｕ邋ｉ邋＾邋ｕ逡逑＿邋．、，之逦＾逡逑图２－１邋Ｓｅｎｎｏｓｉｄｅ邋Ａ不直接促进结肠可见腺瘤的形成逡逑Ａ．邋ＳｅｎｎｏｓｉｄｅＡ不同剂量（２５，５０，１００ｍｇ／ｋｇ）长期使用未见可见腺瘤的形成；Ｂ．邋ＳｅｎｎｏｓｉｄｅＡ逡逑不同剂量长期使用
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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