【摘要】：目的:他莫昔芬对ERα阳性的乳腺癌患者有良好的治疗效果,但是耐药性的出现限制其效果和应用。目前认为细胞自噬可能为导致他莫昔芬耐药性的关键机制之一,但此种保护性自噬形成的具体分子机制及如何促使他莫昔芬产生耐药性尚未阐明。藁本内酯为当归、川芎中的主要活性成分之一,在目前的研究中,仅有一篇文献指出藁本内酯能调控TNF-α诱导的细胞自噬,它对自噬的具体作用并未做探究,且藁本内酯能否恢复耐药ERα阳性乳腺癌细胞的他莫昔芬敏感性也还未见报道。本研究拟首先阐明他莫昔芬耐药性产生过程中保护性自噬形成的机制,并且明确保护性自噬对DNA损伤修护机制的影响,进而揭示他莫昔芬耐药性产生的机制。同时,以藁本内酯为研究对象,对其抑制自噬及DNA损伤修护机制和恢复耐-他莫昔芬的ERα阳性乳腺癌细胞的敏感性进行了初步探索。方法:采用高浓度短时间他莫昔芬冲击法诱导乳腺癌细胞的耐药性。在表征敏感株与耐药株之间的区别方面:以磺酰罗丹明B法检测他莫昔芬对敏感株和耐药株细胞存活率的影响。再以GFP-LC3观察敏感株和耐药株中基础自噬水平的差别;采用Western blotting检测相关蛋白的表达辅以验证。随后加入自噬抑制剂氯喹探讨耐药株中的自噬是否对其存活有保护作用。最后用免疫共沉淀的方法探讨耐药株中自噬水平升高的分子机制。在考察藁本内酯对细胞自噬的调控作用及其分子机制方面:首先RFP-LC3和Western blotting检测藁本内酯对细胞自噬的调控作用;加入氯喹联合处理辅以验证。后以tf-mRFP-GFP-LC3质粒、GFP-LC3RFP-LAMP1质粒瞬时转染、检测组织蛋白酶D的表达和溶酶体的pH等实验确定藁本内酯调控自噬的机制。在考察藁本内酯恢复耐药乳腺癌细胞的他莫昔芬敏感性方面:首先以磺酰罗丹明B法检测藁本内酯单独或联合他莫昔芬对耐药乳腺癌细胞存活率的影响,同时以克隆形成实验和Hoechst33342染色辅以验证。再检测PARP的表达以及泛Caspase抑制剂(Z-VAD-FMK)对细胞存活率的恢复作用,考察藁本内酯恢复他莫昔芬细胞毒性是否通过Caspase途径。在考察DNA损伤及藁本内酯是否干扰DNA损伤修复机制方面:首先考察DNA损伤相关蛋白的表达情况,进一步地采用shRNA抑制Nur77的表达后,考察是否Nur77对耐药株DNA损伤水平和细胞存活率有影响。接下来加入泛素化抑制剂MG132、siRNA抑制Beclin1、藁本内酯、氯喹处理细胞,通过Western blotting检测Nur77能否被恢复表达。最后通过免疫共沉淀和DNA亲和沉淀实验(DAPA)法探讨藁本内酯如何通过Nur77干扰DNA损伤修复途径的机制。结果:对比MCF-7和T-47D细胞,MCF-7TR5和T-47DTR5细胞对~5μM的他莫昔芬表现出良好的耐受性。GFP-LC3质粒瞬时转染后,比之MCF-7细胞,MCF-7TR5细胞中观察到绿色点状荧光聚集,自噬标记物LC3-II/I、p62蛋白的表达下降,且BRCA1、Nur77等蛋白表达也降低;而通过氯喹抑制自噬后能明显增强他莫昔芬的细胞毒性;最后,免疫共沉淀实验结果表明Beclin1-PI3KC3-ATG14复合物结合增加。mRFP-LC3质粒瞬时转染MCF-7TR5细胞后,藁本内酯能明显增加细胞内红色点状荧光聚集;进一步的Western blotting结果表明藁本内酯以时间-和剂量-依赖性方式增加LC3-II/I和p62的表达,与氯喹类似。随后tf-mRFP-GPF-LC3转染MCF-7TR5细胞后,藁本内酯和氯喹诱导MCF-7TR5细胞中黄色荧光增加;GFPLC3和RFP-LAMP1共同转染MCF-7TR5细胞,藁本内酯导致细胞内黄色荧光减少,二者均表明自噬-溶酶体融合受阻。进一步地实验结果表明藁本内酯能下调组织蛋白酶D的表达,并中和溶酶体pH。藁本内酯联合他莫昔芬处理耐药乳腺癌细胞后,实验表明联合给药能够增加耐药乳腺癌细胞的凋亡,降低耐药乳腺癌细胞存活率及细胞集落的形成。然而活化的PARP表达没有变化;与之相符合的是泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK也不能恢复联合给药下调的细胞存活率。对比MCF-7细胞,MCF-7TR5细胞中BRCA1、RAD51表达下降,表明DNA损伤修复的同源重组修复途径受损,而Ku80表达上升,则DNA损伤修复的非同源性末端接合机制启动。实验结果表明MCF-7TR5细胞中γ-H2AX的表达高于MCF-7细胞;随后对比单独的他莫昔芬,藁本内酯联合他莫昔芬能上调细胞内γ-H2AX的表达。sh-RNA法抑制细胞内Nur77的表达后,联合给药导致的γ-H2AX表达积累和下调MCF-7TR5细胞存活率的作用被逆转。随后,MG132、siRNA抑制Beclin1、氯喹和藁本内酯分别处理细胞后,结果表明只有抑制自噬能够恢复Nur77的表达。接下来,免疫共沉淀法证实在MCF-7TR5细胞中,Nur77与Ku80的相互作用减弱,但藁本内酯能够增强二者的相互作用;最后DNA亲和沉淀实验证实藁本内酯能够抑制Ku80和DNA-PKcs分别与DNA-末端的结合作用。结论:本研究表明随着他莫昔芬的治疗,乳腺癌细胞内Beclin1与Bcl2的结合减弱,释放出Beclin1,导致Beclin1-PI3KC3-ATG14复合物结合增加,自噬水平上升,产生耐药性促进癌细胞存活。此外,由于BRCA1和RAD51表达的下降,Ku80表达的升高,MCF-7TR5细胞出现更高的DNA损伤水平。有趣的是,耐药株中过高的细胞自噬导致Nur77的表达降低,使其与Ku80形成的复合物降低,导致非同源重组修复水平升高。在细胞自噬方面,藁本内酯通过干扰自噬体与溶酶体的融合和影响溶酶体功能抑制自噬。更重要的是,藁本内酯抑制自噬恢复MCF-7TR5细胞中Nur77的表达,从而促进Nur77与Ku80的相互作用,导致DNA-PKcs和Ku80分别与DNA-末端的结合作用受到抑制,干扰DNA损伤修复,最终增强他莫昔芬的细胞毒性。本研究不仅对乳腺癌细胞中他莫昔芬耐药性的形成进行了深入探讨,且证实藁本内酯是一种有效的自噬抑制剂,并且在抗肿瘤的联合治疗方面可能具有潜在作用。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285
【参考文献】
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