【摘要】：研究背景及实验目的:根据世界卫生组织报道,癌症是全球第二大死因,2012年约有1400万新发癌症病例,2015年造成880万例死亡,其中肝癌位居第二位(78.8万例死亡)[1]。在中国,肝癌每年新发病例数为36.6万人,每年死亡病例数为32.1万,位居全国癌症死亡第二位。肝癌约有80%-90%是原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC),目前运用于临床的治疗原发性肝细胞肝癌的方法主要有:手术切除及微创介入治疗、放疗、化疗及生物细胞免疫疗法、中医药等综合治疗。中医药在治疗原发性肝癌中有巨大的发展空间,根据临床观察及报道,肝癌患者治疗过程中配合中医药,可以延长生存期,提高生命质量。而在中药及其提取物中发现有效抗肿瘤细胞增殖及侵袭的成分并阐明其分子作用机制,成为新药研发发展方向之一。漏芦作为清热解毒类中药的代表药物之一,在原发性肝癌的临床中医药治疗中,被广泛应用并取得相关的经验支持和部分实验支持;相关药理实验表明,噻吩类化合物存在于漏芦中,此类化合物能够对于肿瘤多药耐药有逆转作用,并且对于肿瘤细胞的凋亡有诱导,因此肿瘤的化疗效果会提高。但对于其抗肿瘤细胞增殖及侵袭的内在分子作用机制仍为未明确。本课题组前期研究表明,flila-EGFP转基因斑马鱼新生血管可以被漏芦水提物所抑制,其作用机制与促进TIE1的基因表达从而负反馈调节ANGPT-TIE信号通路相关[2]。肝细胞肝癌是一个涉及多基因、多位点、多通路改变的渐进过程。PAK家族是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,进化保守,是Rho家族特别是小鸟苷三磷酸酶Cdc42,Rac和Rho下游重要的靶蛋白,可被细胞外信号活化,参与调节细胞骨架、细胞凋亡、细胞周期及有丝分裂、基因转录调节和血管生成等生物学功能,在肿瘤的发生、侵袭与转移过程中可发挥重要作用。PAK4(p21-activated protein kinase 4)属于PAK家族,在多种肿瘤中如乳腺癌、胰腺癌、肝癌、结直肠癌、甲状腺癌、绒毛膜癌中高表达或异常活化[3-7]。本课题探讨选用人肝癌细胞HepG2,采用漏芦水提物处理该细胞,观察HepG2细胞的生长情况,观察HepG2细胞活力及增殖等情况,并结合相关基因组生物信息学,进行高通量转录组测序,即RNA-seq,进行分析数据,分析相关基因的差异表达,筛选出肿瘤相关基因PAK4,研究其内在的分子机制,为漏芦作为抗肝癌药物提供客观的实验依据。实验方法:1.使用传统煎煮药物及干燥浓缩的方法,将漏芦生药3次煎煮后混合收膏并干燥打粉作为实验用药。2.漏芦水提物对HepG2的细胞活力检测实验。分别以不同浓度的漏芦水提物(1.00E+00,1.00E-01,1.00E-02,1.00E-03,1.00E-04,1.00E-05,1.00E-06,1.00E-07,8个工作浓度的漏芦水提物培养基)处理HepG2细胞,采用Cell Titer-Glo细胞活力检测法检测漏芦水提物对HepG2细胞的抑制率,并计算其半数抑制浓度IC50。3.基因的高通量分析RNA-seq:利用基因芯片法(RNA-seq)对漏芦水提物处理后的HepG2细胞进行检测,并分别计算基因水平和转录本水平表达差异情况,筛选出的样品间或组间差异表达基因。4.以漏芦水提物(0.29mg/ml,IC50)处理HepG2细胞72小时,利用实时荧光定量PCR技术检测漏芦水提物处理细胞后PAK4基因m RNA的表达量。5.以漏芦水提物(0.29mg/ml,IC50)处理HepG2细胞72小时,利用Western Blot技术检测漏芦水提物处理细胞后PAK4基因蛋白的表达量。研究结果:1.漏芦水提物组能够抑制HepG2细胞活力,且随药物浓度增加而明显增强(p0.01);测得72小时漏芦水提物对人肝癌细胞HepG2的半数抑制浓度IC50为0.29mg/ml。2.Cell Titer-Glo荧光细胞活性检测实验检测漏芦水提物对HepG2细胞的抑制率,并绘制细胞生长曲线,显示漏芦水提物对HepG2细胞活力有抑制作用。3.高通量RNA-seq测序分析漏芦水提物作用于HepG2细胞后基因差异表达水平,进行转录丰度计算后得出:对照组检测到基因表达数为10726个,转录本数目为23242个;治疗组(漏芦水提物组)基因表达数为10922个,转录本为23184个。4.高通量测序基因和转录本差异表达,PAK4基因表达差异显著,log2(fold change)为-1.742405725,p-value为0.00037379。5.经PAK4基因q RT-PCR和Western Blot实验验证,漏芦水提物抑制人肝癌细胞HepG2的活力机制与下调PAK4基因表达有关。结论:1.漏芦水提物对人肝癌细胞HepG2的细胞活力具有抑制作用;2.漏芦水提物抑制人肝癌细胞HepG2活力的分子机制与下调PAK4基因的表达有关。
【图文】：
成都中医药大学 2018 届硕士学火山图（Volcano Plot）也是测序和芯片数据常用火山图可以对不同样本组间差异表达基因进行图形选得到差异表达基因[log2(FPKM Fold Change)]和筛并绘制火山图，这样可以直观的展示基因在样本组的统计学显著性之间的关系。通过筛选及评估，上82 个，，表达不显著的基因有 10790 个，绘制火山图
PAK4基因荧光定量PCR扩增曲线
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【参考文献】
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