环孢素A大鼠肝肾毒性代谢组学及五味子醇提物的保护作用研究

发布时间：2020-04-11 13:42

【摘要】：目的:环孢素A(Cyclosporine A,CsA)是临床上常用的一种强有效的免疫抑制剂,普遍用于免疫性疾病及人体器官移植术后。但随着CsA的广泛使用,其毒副作用也日渐明显,包括对肾脏、肝脏在内的人体主要器官的毒性作用被相继报道。然而临床上器官移植术后,术者需服用相当长时间的高剂量的环孢素A以抵抗免疫排斥,这就为药物毒性的出现提供了诱导条件。虽然临床上患者服用CsA伴随着血药浓度的监控,但只能通过降低CsA的用药剂量来控制毒副作用的损害且对患者术后恢复及生活质量造成影响。本研究拟在代谢组学技术的支持下,探寻CsA肝肾毒性发生的体内生物标志物,发现CsA毒性作用产生的相关代谢路径,并结合当前临床患者配伍服用五味子类制剂前提条件及课题组前期五味子提取物的相关研究,阐明五味子醇提物对CsA肝肾毒性保护机制的机制,为CsA的合理应用提供参考依据。方法:1.五味子醇提物指纹图谱的建立通过对比不同流动相系统、柱温、流速和检测波长下的色谱图谱,优化并确定色谱条件;运用中药指纹色谱指纹图谱相似度评价系统对10批次五味子醇提物色谱图进行相似度评价,建立五味子醇提物HPLC指纹图谱。2.CsA诱导大鼠肝肾损伤的代谢组学研究根据临床成人器官移植术后CsA维持的高剂量及时间,换算大鼠生物等效剂量为50 mg/kg·d~(-1),作用时间为7天。分别给予SD大鼠50 mg/kg·d~(-1) CsA 1天、3天、7天,观察对不同时间CsA作用下各组大鼠影响。检测各组大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转氨酶(AST)评价大鼠肝脏功能水平;检测各组大鼠血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)评价大鼠肾脏功能水平。大鼠肝脏肾脏组织进行HE染色观察组织病理损伤。收集各组大鼠牺牲前24h尿液,采用LC-MS/MS手段收集尿液中代谢离子信息,运用XCMS软件对质谱数据进行分析,其中代谢物的鉴定和代谢通路分析基于数据库KEGG(http://www.kegg.jp/)。3.五味子醇提物对CsA大鼠肝肾毒性保护作用机制研究在第二章研究基础上,本章依据临床高剂量维持时间增加CsA处理14天组别,用于验证五味子醇提物对CsA肝肾毒性的影响。分别给予SD大鼠50 mg/kg·d~(-1) CsA及联合给予五味子醇提物216 mg/kg·d~(-1) 3天、7天、14天,观察对不同时间五味子醇提物对CsA大鼠的影响。检测各组大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转氨酶(AST)用以评价大鼠肝脏功能水平;检测各组大鼠血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)用以评价大鼠肾脏功能水平;大鼠肝脏肾脏组织进行HE染色观察组织病理损伤;检测肝肾组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)用以评价大鼠氧化应激水平;Western Blot检测大鼠肝脏、肾脏4HNE、Nrf2、HO-1、NQO1、GCLM、Casepase-3、Bax、及Bcl-2表达水平,研究五味子醇提物保护CsA大鼠肝肾毒性作用的机制。结果:1.建立五味子醇提物HPLC指纹图谱。10批次五味子醇提物液相色谱图谱共标示了15个共有峰,并对其中四个共有峰进行了成分指认,分别是五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素,且10批次五味子醇提物的相似度均在0.942以上。2.CsA 50 mg/kg·d-1分别作用处理大鼠1天、3天、7天,传统肝肾毒性损伤指标表明1天组大鼠肝脏功能指标(ALT、AST)和肾脏功能指标(CRE、BUN)未出现明显改变,3天和7天组肝脏和肾脏功能指标出现显著性差异变化;同时病理组织结果显示:1天组肝肾组织未出现改变,而3天组可见明显炎症细胞浸润,7天组可见明显病理结构改变表明肝脏肾脏毒性的形成。收集各大鼠24h尿液,并运用LC-MS/MS对收集到的尿液进行代谢物分析。经过LC-MS/MS技术检测,分析质谱下机数据共得到鉴定离子11555个。通过标准偏差分析(RSD≤30%)后共筛选出差异离子7657个,其中1天组3469个,包含2532个上调离子和937个下调离子;3天组3403个,包含2360个上调离子和1043个下调离子;7天组5393个,包含2283个上调离子和3110个下调离子。运用差异倍数分析及t检验分析并取3个实验组与空白组对比后的数据交集,通过筛选三组共同存在的代谢产物,共得到697个代谢离子物。在697个鉴定的差异代谢物中,再通过KEGG富集分析及HMDB富集分析,15种代谢物被选为可能的代谢标志物,包括氨基天冬氨酸、尿酸、丝氨酸磷酸乙醇胺、D-4'-磷酸泛酸、二磷酸脱氧胞苷、脱氧尿苷二磷酸盐、氨乙基磷酸盐、二碘酪氨酸、二磷酸胞苷乙醇胺、腺苷酸琥珀酸、胞磷胆碱、脱氧腺苷三磷酸盐、脱氧次黄苷三磷酸盐、乙酰胞壁酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。15种代谢标志物涉及的代谢通路包括嘧啶代谢、嘌呤代谢、氨基酸代谢、甘油磷脂代谢、谷胱甘肽代谢。3.为了验证五味子醇提物对CsA大鼠肝肾毒性的影响,分别给予大鼠CsA 50 mg/kg·d~-11 3天、7天、14天,并在给与CsA的同时给予五味子醇提物216 mg/kg·d~(-1),其中单独给予CsA组大鼠肝脏肾脏毒性改变随时间的延长而加重,但同时给予CsA和五味子醇提物的大鼠肝肾毒性明显减轻,表现在肝肾功能及病理方面。其中在14天组实验中,在CsA能够精准造成肝肾病理改变的情况下,五味子醇提物能够明显延缓肝肾组织病理发生改变。同时五味子醇提物能够提高肝肾组织中MDA、SOD、CAT、GSH水平的改变。Western Blot结果显示五味子醇提物能够上调组织中Nrf2、NQO1、HO-1、GCLM和Bcl-2的表达水平,下调组织中Casepase-3、Bax表达水平。结论:本研究成功建立五味子醇提物指纹图谱,为五味子醇提物的提取方法及质量控制提供保证;用LC-MS/MS代谢组学技术方法,成功筛选出CsA诱导肝肾毒性的大鼠体内生物标志物,为CsA早期肝肾毒性的诊断提供了可靠依据;五味子醇提物对大鼠CsA诱导肝肾毒性的保护作用机制可能是激活Nrf2信号通路调控机体氧化应激和抑制组织细胞凋亡的发生来实现的。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】