附子水溶性化学成分及其心脏毒性研究

发布时间：2020-04-11 14:58

【摘要】：利用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、MCI柱色谱、C_(18)反相柱色谱、制备薄层色谱、C_(18)反相半制备型高效液相色谱法、重结晶法等多种色谱分离手段,从附子(Aconiti Lateralis Radix Praeparata)水提液正丁醇部位,分离纯化得到16个化合物,通过NMR、MS等手段进行结构鉴定了13个化合物,鉴定结果分别为Songorine(宋果灵,1)、Hetisine(2)、Neoline(尼奥灵,3)、Karacoline(多根乌头碱,4)、Beiwucine III(5)、N-(2'-β-D-glucopyranosyl-5'-hydroxysalicyl)-4-hydroxyanthranilic acid methyl ester[N-(2'-β-D-吡喃葡萄糖基-5'-羟基水杨基)-4-羟基邻氨基苯甲酸甲酯,6]、Adenosine(腺嘌呤核苷,7)、Adenine(腺嘌呤,8)、Carnine(次黄嘌呤核苷,9)、Hypoxanthine(次黄嘌呤,10)、Pennogenin(偏诺皂苷元,11)、2,3-Furandiol(2,3-呋喃二醇,12)、Benzoic acid(苯甲酸,13),14、15、16初步鉴定为2个木脂素苷和1个芳香族苷类成分,目前正在使用2D-NMR谱进行结构确证,可能为3个新化合物。其中化合物11为首次从附子中分离得到的化合物类型,化合物12为首次从附子中分离得到的化合物。采用酸性染料比色法和高效液相色谱法,分别对附子七种炮制品及其水煎液中生物碱类成分进行分析。从化学成分的角度上,阐释了附子炮制减毒和久煎减毒特性,分析不同炮制工艺对附子中生物碱类成分的影响。结果表明,通过炮制和久煎,不同炮制品均可显著降低附子中双酯型生物碱的含量,破坏率达95%以上。经过胆巴制和漂洗可能会使附子中生物碱类成分大量流失,而未经胆巴制和漂洗的品种则保留了更多生物碱类成分。选用心脏特异表达绿色荧光斑马鱼作为实验动物,进一步对附子不同炮制品的水煎液、水煎液中总生物碱及单一生物碱类成分的毒性进行研究。结果表明,在给药剂量(附子生药量80 mg/mL)下,水煎液会造成斑马鱼心律失常和死亡,对斑马鱼躯体和心脏形态无显著影响,与其中生物碱含量无相关性;水煎液中总生物碱对斑马鱼的毒性相对较低,主要造成降心率作用,但会造成斑马鱼轻微躯体弯曲、心包囊肿和充血。单一生物碱中,对斑马鱼胚胎毒性:双酯型单酯型≈胺醇型,双酯型生物碱毒性:新乌头碱乌头碱次乌头碱,主要表现为严重的心律失常,最高剂量组在给药后24 h,斑马鱼出现濒死状态。此外,还会造成躯体弯曲、心包囊肿、充血、房室不齐和心室停搏。单酯型生物碱和胺醇型生物碱毒性较低,主要为降心率作用,对斑马鱼躯体和心脏形态均无明显毒性。创新点:(1)从附子水煎液正丁醇部位分离纯化得到16个单体化合物,鉴定出13,另外3个化合物初步鉴定为2个木脂素苷和1个芳香族苷,推测为新化合物。化合物11为首次从附子中分离得到的化合物类型,化合物12为首次从附子中分离得到的化合物。(2)从化学的角度,阐明炮制和久煎的减毒特性,提出影响附子不同炮制品生物碱类成分含量的关键工艺为胆巴制和漂洗工艺。(3)首次采用斑马鱼作为实验动物对附子不同炮制品水煎液及其中总生物碱心脏毒性进行研究。(4)首次采用斑马鱼作为实验动物对不同给药时间和剂量的乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酰新乌头碱、苯甲酰次乌头碱、宋果灵、多根乌头碱心脏毒性进行研究。
【图文】：

流程图,附子,流程图,回收溶剂

色谱甲醇(美国 Fisher 公司)；甲醇、氨水、二氯甲烷、三氯甲烷均为分析自于成都市科龙化工试剂厂，水为实验室自制超纯水(电阻率 18.25 MΩ ℃)。显色剂：碘化铋钾试液、10%硫酸乙醇试液。提取与分离取生附片粉末 5.5 kg，，加 10 倍量水煎煮 5 次，每次 3 小时，纱布滤过滤液，减压回收溶剂至一定体积，置于 5000 mL 分液漏斗中，加水饱和醇等体积萃取至上层液体近无色，分别减压回收溶剂，得正丁醇部位和水部正丁醇部位(43 g)，加硅胶拌样，进行硅胶柱(200～300 目，800 g，7.5×40谱分离，用三氯甲烷-甲醇(100:0-0:100)梯度洗脱，洗脱液经薄层色谱检测相似的流份，回收溶剂得到 13 个组分(AC-1～AC-13)。

色谱,分离流程,二氯甲烷,甲醇

图 1-2AC-4 分离流程图CI 柱色谱分离，0%-100%甲醇-水梯度洗脱，洗脱液相似的流份，回收溶剂得到六个亚组分(AC-5-1～hadex LH-20 葡聚糖凝胶柱色谱(三氯甲烷-甲醇 1:1色谱(二氯甲烷-甲醇 5:1 展开)纯化，得到 1 (27 mg二氯甲烷-甲醇(100:0-0:100)梯度洗脱得到 2-6-26)，将 AC-5-6-5 经过制备薄层色谱(二氯甲烷重结晶得到 11 (13 mg)。将 AC-5-6-11 经过 Sepha(三氯甲烷-甲醇 1:1 洗脱)分离，再经过重结晶得到
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284;R285.5

【参考文献】