基于Notch1信号通路探讨丹酚酸A对人胚肺成纤维细胞MRC-5抗纤维化作用机制的研究

发布时间：2020-04-13 07:57

【摘要】：目的:肺纤维化(PF)是间质性肺疾病的共同病理结局,是以肺泡壁病变为主,涉及周围组织及相邻结构的一组非感染性疾病群。其发病率高,死亡率大,病程一般呈进行性发展,目前尚缺乏确切有效的临床治疗药物。现代研究发现,氧化应激诱导的细胞氧化/抗氧化失衡是促使肺纤维化形成及进展的关键。Notch1信号通路参与了肺纤维化的发生和发展,阻断这一通路可减少肌成纤维细胞的生成,抑制上皮-间质转化(EMT),从而延缓肺纤维化的进展。该实验通过人胚肺成纤维细胞(MRC-5)氧化损伤造模后给予不同浓度丹酚酸A干预,观察丹酚酸A对MRC-5细胞氧化应激损伤的保护作用;干预Notch1信号通路,观察丹酚酸A对MRC-5细胞氧化/抗氧化失衡机制的调节。方法:首先建立H_2O_2诱导的MRC-5细胞氧化损伤模型,选取分别浓度为200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L、800μmol/L、1000μmol/L的H_2O_2,分别孵育6h、12h、24h,MTT法检测不同浓度的H_2O_2作用于MRC-5细胞的抑制率,选取H_2O_2最佳造模浓度和造模时间进行后续试验。然后分别选取浓度为5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.3125mg/ml、0.1562mg/ml的丹酚酸A,运用CCK-8法测定不同浓度丹酚酸A对MRC-5细胞增殖的抑制情况,选取实验的最大无毒浓度,以此稀释三个浓度,处理MRC-5细胞。实验设置空白组(A组)、H_2O_2组(B组)、丹酚酸A高浓度组(C组)、H_2O_2+丹酚酸A高浓度组(D组)、H_2O_2+丹酚酸A中浓度组(E组)、H_2O_2+丹酚酸A低浓度组(F组)。以6h、12h、24h为时间监测点,检测各组各时间点SOD、CAT、MDA、GSH的表达并比较。基于Notch1信号通路探讨丹酚酸A对H_2O_2致MRC-5细胞氧化应激损伤保护机制。Western blotting检测各组24h Notch1、JAG1、Hes1的蛋白表达;RT-PCR检测各组24h Notch1mRNA、JAG1mRNA、Hes1mRNA的表达;用免疫荧光化学法观察24h胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ的表达。结果:1.H_2O_2最佳造模浓度以及丹酚酸A最佳作用浓度的选择1.1当H_2O_2浓度600μmol/L孵育24h时,使细胞抑制率达到33.96%,该刺激浓度、作用时间以及对于细胞的损伤抑制程度符合最佳造模需求,故以600μmol/L H_2O_2预刺激24小时诱导的MRC-5氧化损伤模型进行后续实验。1.2.当丹酚酸A的药物浓度达2.5mg/ml时,使细胞抑制率达到10.94%,该药物剂量下,细胞抑制率较低,对MRC-5细胞损伤小,药物浓度相对安全,可以考虑将2.5mg/ml定为该实验的药物最大无毒浓度进行后续实验。2.观察丹酚酸A对H_2O_2诱导MRC-5细胞氧化损伤的保护作用丹酚酸A能明显提高MRC-5细胞内各抗氧化指标SOD、CAT、GSH活力,同时能显著降低提示机体氧化损伤的指标MDA表达水平,显示有浓度依赖性,统计学意义显著(P0.05)。3.基于Notch1信号通路探讨丹酚酸A对H_2O_2致MRC-5细胞氧化应激损伤保护机制丹酚酸A能明显降低H_2O_2诱导的MRC-5细胞Notch1,JAG1,Hes1的表达水平,具有统计学意义(P0.05)。4.观察丹酚酸A对MRC-5细胞24h胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ的表达丹酚酸A能够明显抑制MRC-5细胞胶原蛋白的表达,提高机体的抗氧化能力。结论:1.一定浓度的丹酚酸A可上调MRC-5细胞应激水平发挥对氧化损伤的治疗作用。2.H_2O_2干预可以上调Notch1、JAG1、Hes1的表达,一定浓度的丹酚酸A可以显著下调Notch1、JAG1、Hes1的表达,提示Notch1信号通路在氧化应激损伤过程中扮演重要角色,丹酚酸A可以有效拮抗MRC-5细胞氧化应激损伤,且通过调控Notch1信号通路实现,发挥抗氧化的作用。3.丹酚酸A能够抑制胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ的表达,提示一定浓度的丹酚酸A具有上调机体抗氧化损伤的作用。
【图文】：

图 1 不同浓度差异的 H2O2不同作用时间对 MRC-5 细胞损伤的影响8 法测定不同浓度丹酚酸 A 对 MRC-5 细胞增殖的抑制情况 2 可以看出，，与对照组相比，随着丹酚酸 A 药物作用浓度的不断抑制程度逐渐增强，此过程呈现出浓度依赖性，当丹酚酸 A 的药 时，使细胞抑制率达到 10.94%，该药物剂量下，细胞抑制率较低小，药物浓度相对安全，可以考虑将 2.5mg/ml 丹酚酸 A 药物浓度无毒浓度，以此稀释三个浓度，分别以 2.5mg/ml、1.25mg/ml、0低浓度处理 MRC-5 细胞。

1 不同浓度差异的 H2O2不同作用时间对 MRC-5 细胞损伤的测定不同浓度丹酚酸 A 对 MRC-5 细胞增殖的抑制情况以看出，与对照组相比，随着丹酚酸 A 药物作用浓度的不制程度逐渐增强，此过程呈现出浓度依赖性，当丹酚酸 A ，使细胞抑制率达到 10.94%，该药物剂量下，细胞抑制率较药物浓度相对安全，可以考虑将 2.5mg/ml 丹酚酸 A 药物浓度，以此稀释三个浓度，分别以 2.5mg/ml、1.25mg/ml度处理 MRC-5 细胞。
【学位授予单位】：山东中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】

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本文编号：2625784