葡萄糖醛酸化通路在大黄素肝肾代谢及解毒中的基础作用

发布时间：2020-04-13 11:25

【摘要】：一、研究背景与目的大黄素(Emodin)是大黄、何首乌等多种药材中的主要有效及毒性成分。大黄素剂量过高或长时间应用会产生肝肾损伤,中医通常通过炮制、配伍等手段减轻其毒性作用,但具体机理和理论支撑尚不完善。大黄素在体内70%以上代谢被UGT代谢,葡萄糖醛酸化转移酶(UDP-glucuronosyltransferases,UGT)是II相代谢中重要的解毒酶,受肝肾中多种转录因子组成的调控网络影响。本文基于转录组测序考察了大黄素的肝肾代谢机理并探寻其代谢解毒途径,为大黄、何首乌等中药的临床解毒应用提供科学理论依据。二、研究方法1.本研究将肝肾组织均质化后通过差速离心制得富含代谢酶的肝肾微粒体,以染料木素、霉酚酸、齐多夫定分别作为UGTs、UGT1A9和UGT2B7的底物探针验证肝肾微粒体的活性。2经多元线性回归分析样本临床基线资料,利用R软件分析影响大黄素肝肾代谢的转录因子和UGTs并比较肝肾差异。3.通过大黄素在55例肝和36例肾微粒体及重组UGT酶中的代谢计算各UGTs在大黄素肝肾代谢中的贡献度。利用UGT探针底物表征的酶活性对贡献度大的关键酶进行相关性验证。4.采用MTT法检测大黄素和其代谢产物的细胞毒性。利用siRNA敲低HepG2细胞中的UGT2B7,并用荧光定量PCR技术和Western-blot技术验证转染效果;考察大黄素在siRNA-UGT2B7-HepG2细胞裂解物中的酶代动力学特征及细胞毒性的变化。三、结果与结论1.肝脏中 UGT1A1,UGT1A3,UGT1A4,UGT1A6,UGT1A9,UGT2B4,UGT2B7,UGT2B15 和 UGT2B17 表达丰富;肾脏中 UGT1A6,UGT1A9 和UGT2B7有丰富的表达。2.重组人 UGT 酶实验中 UGT1A1,UGT1A7,UGT1A8,UGT1A9,UGT1A10,和UGT2B7均参与了大黄素的代谢。大黄素在肝微粒体中的平均代谢速率是肾微粒体中的 1.55 倍(V肝=10.14 ± 0.537 nmol/mg/min;V肾=6.53 ± 0.208 nmol/mg/min)。对大黄素肝代谢贡献度最大的酶依次是UGT2B7(51.71%)UGT1A1(24.39%)UGT1A9(13.84%);其代谢速率与 UGT1A9 和 UGT2B7酶活性均成正相关(r UGT1A9=0.4369,P UGT1A9 =0.0019;rUGT2B7=0.6384,PUGT2B70.0001)。对大黄素肾脏代谢贡献度最高的UGT亚型是UGT2B7(50.49%)和UGT1A9(47.87%);其代谢速率与UGT1A9和UGT2B7的酶活性高度相关(r UGT1A9=0.7678,P UGT1A90.000 1;rUGT2B7= 0.6338,PUGT2B70.0001)。故 UGT2B7 和UGT1A9是大黄素肝肾代谢中的关键酶。3.大黄素在肝肾微粒体中的代谢个体差异很大。肝脏中UGTs表达量差异仅可解释大黄素代谢个体差异的15.9%,且UGT1A9的表达量与大黄素肝代谢速率呈正相关(P=0.044)。在肾脏中UGT表达量差异可以解释57.0%大黄素代谢个体差异。其中转录因子HNF4α与UGT1A9/2B7表达及大黄素代谢均呈正相关,NF-κB与UGT1A9/2B7表达及大黄素代谢均呈负相关。4.大黄素UGT代谢产物对HepG2细胞毒性弱于大黄素。siRNA-UGT2B7-HepG2中UGT2B7的基因和蛋白表达量均显著降低。大黄素对siRNA-UGT2B7-HepG2的毒性明显增高(P=0.022);对UGT酶的亲和力(Km(siRNA-UGT2B7)=116.39±13.28μM Km(control)=71.75±2.38μM)和清除率(CL csiRNA-UGT2B7)=0.0021ml/min/mg;CL(control)=0.0060ml/min/mg)均下降。故 UGT2B7代谢是大黄素的重要解毒途径。
【图文】：

３．２．２线性范围逡逑分别以染料木素、霉酚酸、齐多夫定的浓度为横坐标，以其各自的峰面积／逡逑内标峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图２－２所示，表明染料木素逡逑在０．６２５？８０＾Ｍ浓度范围内线性良好，回归方程为ｙ－０．０５０１ｘ（Ｒ２＝０．９９９２）；霉酚逡逑酸在３．１２５？２００＾ｉＭ浓度范围内线性良好，回归方程为ｙ＝０．０３５２ｘ（Ｒ２＝０．９９９０）；逡逑齐多夫定在９．３７５？６０（ＨｉＭ浓度范围内线性良好，回归方程为ｙ＝０．００７９ｘ逡逑（Ｒ２＝０．９９９４）邋＝逡逑Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ逦ＭＰＡ逦ＡＺＴ逡逑＞＝０．０５０１邋ｘ逦）－＝Ｏ．０３５２ｘ逦５，逦ｐ０．００７９＼逡逑Ｒ：＾）．９９９２逦＾邋Ｒ２邋＝０．９９９０逦，邋Ｒ２＝０．９９９４逡逑６－逦Ｘ邋，４．逦／逡逑／邋ｉｌ邋／逡逑１逦０＊邋＾逦＇１逦１逦１逦１逦１逦０＇邋＾逦１逦１逦—邋１逦＇ｉ逡逑０逦２０逦４０逦６０逦８０逦１００逦０逦５０逦１邋００逦１５０逦２００逦２５０逦０逦２００逦４００逦６００逦８００逡逑Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏａ逦Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋（（ｉＭ）逦Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ逡逑图２－２染料木素（Ａ），霉酚酸（Ｂ）和齐多夫定（Ｃ）的标准曲线。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ２－２．邋Ｔｈｅ邋ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅｓ邋ｏｆ邋ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ（Ａ）

邋２，，邋４，邋６，邋１２邋ｈ取样。结果对各个时间点的霉酚酸峰面积（Ａｓ）与内逡逑标峰面积（Ａｉ）的比值作对比，定义Ｏｍｉｎ时霉酚酸的峰面积比值Ａｓ／Ａｉ为１００％，逡逑以考察霉酚酸在ＫＰＩ溶液中的稳定性。结果如图２－３所示，高中低浓度的霉酚酸逡逑２６逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】

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本文编号：2625945