基于热休克蛋白HSP70启动子筛选抗AD中药研究

发布时间：2020-04-13 13:02

【摘要】：AD是一种渐行性退化的神经系统疾病,其病理特征主要有老年斑、神经纤维缠结、神经元丢失等。其中老年斑主要由Aβ引起,神经纤维缠结主要由Tau的过度磷酸化引起,它们都涉及到了蛋白错误折叠和聚集这一问题。大量研究表明,AD的病因与错误折叠的蛋白质不断地在脑部积累所导致的神经功能异常并最终导致神经元的凋亡密切相关。目前对AD的药物治疗主要集中在AD本身的病理特征上,很少有针对于减少蛋白质的错误折叠来预防和治疗AD的药物。而热休克蛋白在防止蛋白质的错误折叠和聚集,修复错误折叠的蛋白质中发挥着重要作用,尤其是HSP70。研究表明,HSP70在减少Aβ的聚集与积累、恢复Tau蛋白体内平衡、减轻氧化应激程度、抑制神经炎症反应等方面发挥着非常重要的作用,因此可以将HSP70作为抗AD药物靶点来筛选抗AD药物。本研究以HSP70启动子作为目的基因,分别以EGFP和Luciferase作为报告基因,构建pHSP70-EGFP和pGL3-HSP70重组载体,转染HEK 293T细胞,从而构建了基于pHSP70-EGFP的定性筛选细胞模型和基于pGL3-HSP70的定量筛选细胞模型。通过对有关老年痴呆的古方和验方的收集整理,对复方中出现的单味药按照出现的频率进行排序,以其中的单味药作为候选药物,利用定性和定量筛选HSP70启动子激活剂的细胞模型,优先对出现频率较多的35个单味药进行筛选,筛选得到四个HSP70启动子激活剂:黄芩、石菖蒲、蜘蛛香、五味子。用Aβ_(25-35)构建AD细胞模型对这四个单味药水煎液的抗AD效果进行评价,得到的这四个HSP70启动子激活剂都能减少Aβ_(25-35)的细胞毒性,其中黄芩效果最优,同时黄芩水煎液还能抑制PC12细胞的凋亡。综上所述,通过基于HSP70启动子筛选得到的黄芩水煎液具有作为抗AD药物候选物的潜力。
【图文】：

启动子,结构示意图,聚合酶

别的 RNA 聚合酶种类不同分为一类启动子（识别 RNA 聚合酶 I，转录 rRNA）、二类子（识别 RNA 聚合酶 II，转录 mRNA）、三类启动子（识别 RNA 聚合酶 III，转录 tR其他微小 RNA）。人热休克蛋白 HSPA1A 是 HSP70 中应激可诱导的一种应激蛋白，其子属于二类启动子。按照转录模式可将启动子分为：（1）组成型启动子：这类启动子的基因在任何组织器官中的表达基本一样，不受外界刺激的影响，使基因的表达维持一恒定水平；（2）组织特异型启动子：这类启动子对基因的调控具有组织特异性，，只些特定的组织器官中发挥作用，特别是在发育调节中发挥特异的功能；（3）诱导型启：这类启动子在机体受到外界环境的刺激，包括物理刺激和化学刺激时，能够特异性，使其控制的基因的表达显著增高或降低以应对环境的变化，当外界刺激消失时，这动子的活性又回到正常水平。HSPA1A 则属于诱导型启动子。二类启动子一般包括上动子元件（upstream promoter elements, UPE）、TATABox、起始子（initiator）、下游元downstream promoter elements, DPE），如图 2.1 所示。UPE 含有 GC 框、CCAAT 框。动子区中，“CG”的含量较高，将富含“CG”的区域，称为 CpG 岛。CpG 岛的甲基阻止所在启动子的激活。

重组载体,构建过程,质粒

表 2. 4 构建 pHSP70-EGFP 重组载体的 In-Fusion 反应体系ble 2.4 In-Fusion reaction system for pHSP70-EGFP recombinant vector 体积的 HSPA1APromoter DNA 片段（55ng/μL） 1.4μL化的 pEGFP-1 载体（32ng/μL） 3.2μLIn-Fusion HD Enzyme Premix 2μL2O 3.4μL0μL，50℃反应 30min 后，瞬时离心，置冰上 5min，转化 TO3。将重组的质粒命名为 pHSP70-EGFP，提取质粒后进行酶切H2O，1μL Cutsmart，4μL pHSP70-EGFP 质粒，0.4μL BamH℃酶切 30min，将酶切结果正确的质粒送测序。测序结果正确胞实验，质粒大提的方法参照天根生物的无内毒素质粒大提试过程如图 2.2 所示。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R28

【参考文献】