活血通督汤调控大鼠急性脊髓损伤后P2X7受体介导炎症的机制研究

发布时间：2020-04-13 19:11

【摘要】：目的:通过体内外实验观察活血通督汤对小胶质细胞P2X7受体介导炎症的调控作用,探讨活血通督汤对急性脊髓损伤后炎症的作用和机制。方法:1.将144只SPF级SD大鼠(雌雄各半)采用随机数表法随机分为假手术组(Sham)、模型组(Model)、活血通督汤组(HXTDD)、BBG组(BBG)、BzATP组(BzATP)和BzATP+活血通督汤组(BzATP+HXTDD),每组24只。Sham组仅行椎板切除术,其余各组均采用MASCIS脊髓打击器制备急性脊髓损伤模型。Sham组和Model组自术后第1d起,每日给予生理盐水灌胃;HXTDD组自术后第1d起,每日给予活血通督汤灌胃;BBG组自术后第1d起,每日给予BBG腹腔注射;BzATP组于造模前1h给予BzATP腹腔注射,自术后第1d起,每日给予生理盐水灌胃;BzATP+HXTDD组于造模前1h给予BzATP腹腔注射,自术后第1d起,每日给予活血通督汤灌胃。干预3d后,各组大鼠处死、取材。采用尼氏染色观察脊髓和神经元的宏观形态和结构;采用透射电子显微镜观察髓鞘和神经元的微观结构和形态;采用高尔基染色观察脊髓树突和树突棘形态,并计算树突长度和树突棘数量;采用激光共聚焦扫描显微镜观察P2X7R+/IBA1+阳性细胞,并计算P2X7R+/IBA1+阳性细胞数;采用Elisa法检测IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α表达水平;采用Western blot法检测P2X7R蛋白和Caspase1(P20)蛋白表达情况;采用比色法检测脊髓组织中Caspase1的活性;采用荧光定量PCR检测P2X7R mRNA、IL-1βmRNA、IL-6mRNA、IL-18mRNA 和 TNF-αmRNA 表达情况。2.体外培养BV-2小胶质细胞,传代至第3代进行实验。应用LPS预处理BV-2小胶质细胞,再给予BzATP刺激,建立炎症细胞模型。采用MTT法筛选活血通督汤安全浓度范围。将第3代体外培养的BV-2小胶质细胞种板,分为空白对照组(Control)、LPS 组(LPS)、BzATP 组(BzATP)、活血通督汤组(HXTDD)和 A438079 组(A438079)。Control组正常培养;LPS组给予LPS处理;BzATP组给予LPS处理后再给予BzATP处理;HXTDD组给予LPS处理后再同时给予BzATP和活血通督汤处理;A438079组给予LPS处理后再同时给予BzATP和A438079处理。干预完成后,收集细胞和培养基上清液。采用MTT法检测细胞活力,以确定后续实验中活血通督汤最佳药物干预浓度;采用Elisa法检测IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α表达情况;采用Western blot法检测BV-2小胶质细胞中P2X7R蛋白和Caspase1(P20)蛋白表达情况;采用比色法检测BV-2小胶质细胞中Caspase1活性;采用qPCR检测BV-2小胶质细胞中P2X7RmRNA、IL-1βmRNA、IL-6mRNA、IL-18 mRNA 和 TNF-α mRNA 表达情况。结果1第一部分实验结果1.1活血通督汤对脊髓和神经元形态学的影响:尼氏染色显示活血通督汤和BBG可改善急性脊髓损伤后脊髓和神经元的宏观形态;透射电子显微镜显示活血通督汤和BBG可改善急性脊髓损伤后髓鞘和神经元的微观结构和形态;高尔基染色显示,HXTDD组和BBG组的树突长度和树突棘数量显著多于Model组、BzATP组和BzATP+HXTDD组(P＜0.05);激光共聚焦扫描显微镜显示,HXTDD组和BBG组的P2X7R+/IBA1+细胞数显著少于Model组、BzATP组和BzATP+HXTDD组(P0.05)。1.2活血通督汤对炎性因子表达的影响:与Sham组比较,各组大鼠外周血中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α表达水平显著增高(P0.05);HXTDD组和BBG组的IL-1β、IL-6、IL-18 和 TNF-α表达水平显著低于 Model 组、BzATP 组和 BzATP+HXTDD 组(P0.05)。1.3活血通督汤对P2X7R蛋白和Caspase1(P20)蛋白表达的影响:与Sham组比较,各组大鼠脊髓组织中P2X7R蛋白和Caspase1(P20)蛋白表达量显著增高(P0.05);HXTDD组和BBG组的P2X7R蛋白和Caspase1(P20)蛋白表达量显著低于Model组、BzATP 组和 BzATP+HXTDD 组(P0.05)。1.4活血通督汤对Caspase1活性的影响:与Sham组比较,各组大鼠脊髓组织中Caspase1活性显著增高(P＜0.05);HXTDD组和BBG组的Caspase1活性显著低于Model组、BzATP 组和 BzATP+HXTDD 组((P＜0.05)。1.5 活血通督汤对 P2X7R mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、IL-18 mRNA 和 TNF-αmRNA表达的影响:与Sham组比较,各组大鼠脊髓组织中P2X7RmRNA、IL-1βmRNA、IL-6 mRNA、IL-18 mRNA 和 TNF-α mRNA 表达量显著增高(p0.05);HXTDD 组和BBG 组的 P2X7R mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、IL-18 mRNA 和 TNF-α mRNA 表达量显著低于 Model 组、BzATP 组和 BzATP+HXTDD 组(p0.05)。2第二部分实验结果2.1活血通督汤安全浓度范围:活血通督汤在50μg/mL～600μg/mL的浓度范围内对BV-2小胶质细胞无毒,不影响其细胞活力。2.2活血通督汤对细胞活力的影响:与Control组比较,LPS预处理可降低细胞活力(P0.05);LPS预处理后再使用BzATP处理,进一步降低细胞活力(P＜0.05);200μg/mL和400μg/mL浓度的活血通督汤以及A438079可改善经LPS预处理后再经BzATP处理的BV-2小胶质细胞活力(P＜0.05);且200μg/mL浓度的活血通督汤对经LPS预处理后再经BzATP处理的BV-2小胶质细胞活力的改善作用优于400μg/mL浓度的活血通督汤,差异具有统计学意义(P0.05)。因此,活血通督汤的最佳干预浓度被确定为200μg/mL,在后续实验中均使用200μg/mL浓度的活血通督汤进行干预。2.3活血通督汤对炎性因子表达的影响:与Control组比较,其余各组培养基上清液中的IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α表达水平显著升高(P＜0.05),HXTDD组和A438079组培养基上清液中的IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α表达水平显著低于BzATP组(P＜0.05)。2.4活血通督汤对P2X7R蛋白和Caspase1(P20)蛋白表达的影响:与Control组比较,其余各组BV-2小胶质细胞的P2X7R蛋白和Caspase1(P20)蛋白表达量显著增高(P0.05);HXTDD组和A438079组BV-2小胶质细胞的P2X7R蛋白和Caspase1(P20)蛋白表达量显著低于BzATP组(P0.05)。2.5活血通督汤对Caspase1活性的影响:与Control组比较,其余各组BV-2小胶质细胞的Caspase1活性显著增高(P0.05);HXTDD组和A438079组BV-2小胶质细胞的Caspase1活性显著低于BzATP组(P0.05)。2.6 活血通督汤对 P2X7RmRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、IL-18 mRNA 和 TNF-αmRNA表达的影响:与Control组比较,其余各组BV-2小胶质细胞的P2X7R mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、IL-18 mRNA 和 TNF-α mRNA 表达量显著增高(P0.05);HXTDD 组和 A438079 组的 P2X7R mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、IL-18 mRNA和TNF-α mRNA表达量显著低于BzATP组(P0.05)。结论1活血通督汤可抑制急性脊髓损伤后炎症,有效保护损伤处神经元、髓鞘、树突和树突棘的形态结构,减轻炎症对神经系统的损伤。活血通督汤的作用机制与其抑制急性脊髓损伤后小胶质细胞P2X7受体介导的炎症有关。2活血通督汤可在不影响细胞活力的情况下,抑制细胞炎症,下调相关炎性因子表达水平,其机制与活血通督汤抑制小胶质细胞P2X7受体介导的炎症有关。
【图文】：

４实验结果逡逑４．１尼氏染色观察脊髓神经元组织形态逡逑如图１－１和图１－２所示：Ｓｈａｍ组脊髓灰质呈蝴蝶状，结构完整，灰质和白质界限清逡逑晰，神经元胞质内可见斑块状或虎斑样尼氏体，尼氏体饱满、清晰，神经元细胞核大，逡逑核仁明显；Ｍｏｄｅｌ组、ＢｚＡＴＰ组和ＢｚＡＴＰ＋ＨＸＴＤＤ组脊髓结构破坏严重，神经元胞质逡逑内尼氏体较小、碎裂，神经元固缩坏死，溶解、液化后形成较多空泡样结构；ＨＸＴＤＤ逡逑组和ＢＢＧ组脊髓结构较Ｍｏｄｅｌ组、ＢｚＡＴＰ组和ＢｚＡＴＰ＋ＨＸＴＤＤ组有所改善，神经元胞逡逑质内尼氏体较多、较饱满，神经元水肿较轻，神经元形态较好，，空泡样改变较少，损伤逡逑神经元处于恢复状态中，但仍有部分神经元细胞核肿大，核仁消失。说明急性脊髓损伤逡逑后，损伤处神经细胞被严重破坏，活血通督汤和Ｐ２Ｘ７Ｒ抑制剂ＢＢＧ能够减轻急性脊髓逡逑损伤后脊髓和神经元的损伤

注：黑色箭头所示为瘀血，红色箭头所示为尼氏体。逡逑４．２透射电子显微镜观察髓鞘和神经元组织形态逡逑如图１－３所示，透射电子显微镜显示：Ｓｈａｍ组脊髓髓鞘外形规则，呈同心圆状排逡逑列，结构完整、无破裂、无缺失，板层结构完整、致密、均匀，排列规则，神经元线粒逡逑体丰富、饱满且清晰可见，分布均匀，微丝、微管丰富，神经元呈椭圆形，细胞膜结构逡逑完整，细胞器丰富，可见较多线粒体和粗面内质网，线粒体嵴无明显断裂或缺失；Ｍｏｄｅｌ逡逑组、ＢｚＡＴＰ组和ＢｚＡＴＰ＋ＨＸＴＤＤ组脊髓髓鞘外形不规则，结构紊乱，厚薄不一，不完逡逑整，部分髓鞘可见断裂或缺失，局部卷曲、皱褶，板层结构松解、扭曲、皱褶、融合甚逡逑至部分破裂、缺失，神经元线粒体肿胀，数量减少甚至部分线粒体溶解消失，线粒体嵴逡逑断裂、缺失，微丝、微管溶解，数量较少；ＨＸＴＤＤ组和ＢＢＧ组脊髓髓鞘形态有所改逡逑善
【学位授予单位】：福建中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】

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本文编号：2626331