印度獐牙菜乙酸乙酯部位抗肝纤维化活性成分研究

发布时间：2020-04-14 07:12

【摘要】：民族药是祖国医药的瑰宝,在各种疾病的治疗中具有独特的疗效。但与中药相比其研究与开发则远远滞后。因此,增大民族药的基础研究与开发,从民族药的宝库中挖掘有效部位群、单体化合物及先导化合物必将成为未来的研究热点。印度獐牙菜,藏药名“甲蒂”,为龙胆科植物印度獐牙菜Swertia chirayita(Roxb.ex Fleming)H.Karst.的干燥全草,该药在临床上应用的历史悠久,具有抗炎、保肝、退热等功效,且在藏医治疗黄疸型肝炎、病毒性肝炎等肝胆疾病中为首选药物之一,但该药的药效物质基础尚不明确。课题组前期研究显示,印度獐牙菜85%乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位在体内外具有较好的抗肝纤维化活性,为了阐明其药效物质基础,本论文首先对该部位的化学成分进行了系统的分离、纯化与结构鉴定,接着对其中量大的单体化合物进行了体外HSC增殖抑制活性筛选和抗炎作用的研究,最后对该部位中具有体内抗肝纤维化活性化合物当药苦酯苷进行了溶解度和表观油水分配系数的测定,为成药性预测提供药剂学依据。具体研究内容包括以下四部分:1印度獐牙菜乙酸乙酯部位化学成分研究运用多种色谱技术,对印度獐牙菜乙酸乙酯部位进行分离纯化,并依据其理化性质、波谱数据对结构进行分析鉴定。从中分离纯化了32个化合物,其中鉴定出18个化合物,包括6个三萜及其苷元、5个口山酮、3个裂环烯醚萜、2个有机酸、1个黄酮和1个其他类化合物,分别鉴定为雏菊叶龙胆口山酮(1)、1,3,5,8-四羟基口山酮(2)、1,7-二羟基-3,8-二甲氧基口山酮(3)、雏菊叶龙胆苷(4)、swerpunilactone A(5)、蜜桔黄素(6)、齐墩果酸(7)、4-epi-hederagenin(8)、2-epi-corosolic acid(9)、熊果酸(10)、3β,23-二羟基乌索-12-烯-28酸(11)、β-胡萝卜苷(12)、当药苦酯苷(13)、swerimilegenin I(14)、红白金花内酯(15)、儿茶酚(16)、丁香酸(17)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(18)。其中化合物6、8、9、11和17首次从獐牙菜属植物中分离得到,化合物3、5、14和15首次从印度獐牙菜中分离得到。2印度獐牙菜乙酸乙酯部位单体化合物体外抗肝纤维化活性筛选为了评价化合物抗肝纤维化作用,本实验采用MTT法观察了该部位中的主要单体化合物对TGF-β刺激的HSC-T6细胞增殖活性的影响。结果表明,熊果酸和齐墩果酸具有显著的体外抗肝纤维化细胞活性,且随着给药浓度的升高,其抑制HSC增殖的作用逐渐增强,而其余化合物在体外作用不明显。因此,熊果酸和齐墩果酸是该部位中主要抗肝纤维化活性物质。3雏菊叶龙胆口山酮抗炎活性作用及其机制初步研究炎症的发生与肝纤维化密切相关,因此,研究印度獐牙菜乙酸乙酯部位中化合物的抗炎活性及作用机制十分必要。本实验研究了主要成分雏菊叶龙胆口山酮对经LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞中各类因子及蛋白的影响,结果表明其雏菊叶龙胆口山酮在2~16μM浓度下可明显升高细胞活力,对炎症因子TNF-α和IL-6具有显著的抑制作用;可抑制PGE_2、COX-2蛋白的表达;明显抑制Akt、IKKβ、NF-κB p 65、P 38、ERK和JNK蛋白的磷酸化水平;但其对COX-1的蛋白表达无显著影响。结果提示雏菊叶龙胆口山酮具有抗炎活性,并且推测其发挥抗炎活性的机制为抑制COX-2/Akt/NF-κB/MAPKs的信号传导通路。4抗肝纤维化成分当药苦酯苷的理化性质研究水溶性和脂溶性决定着药物在体内的溶解、吸收、分布及排泄,因此应依据生物体内pH值的特点,研究活性化合物在不同pH缓冲液中的溶解度及油水分配系数,为预测药物在体内的过程以及其药剂学性质提供依据。本实验采用HPLC法和摇瓶法分别测定了该部位中另一主要成分环烯醚萜类化合物当药苦酯苷的溶解度及油水分配系数。色谱条件为:色谱柱:Waters C_(18)(250 mm×4.6mm,5μm),流动相:甲醇-水,检测波长:260 nm,流速:1.0 mL/min,柱温:25℃,进样量:20μL。实验结果显示当药苦酯苷在水的平衡溶解度为(150.74±0.78)μg/mL,在不同pH值PBS中,当pH 7.9时最大,表明其为水难溶性化合物且于偏碱性环境中溶解度较大;当药苦酯苷在水和不同pH值PBS中的表观油水分配系数的顺序为:pH 2.5pH 7.4水pH 2.0pH 7.9pH 6.8=pH 5.8pH 5.0,提示当药苦酯苷可能在pH 2~3的酸性环境及pH 7~7.4的偏中性环境中具有较好的脂溶性,易进入细胞膜转运,利于吸收。总之,本课题系统分离了印度獐牙菜乙酸乙酯部位化学成分,筛选了抗肝纤维化活性成分及抗炎成分的研究,确定了活性化合物,并对该部分量大的主要活性化合物进行了理化性质研究,为印度獐獐牙菜的深度开发利用提供了科学依据。
【图文】：

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19图 1-2 印度獐牙菜乙酸乙酯萃取分离流程图Fig.1-2 The separation flow of ethyl acetate fraction from the S. chirayita

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图 2-1 印度獐牙菜乙酸乙酯部位单体化合物对 HSC-T6 抑制作用Fig.2-1 Inhibitory effect of ethyl acetate monomers compounds on theproliferation of HSC-T6 cells from S. chirayita8.2 化合物体外抗肝纤维化活性复筛对初筛显示有抗肝纤维化体外活性的熊果酸和齐墩果酸两个单体化合物整给药浓度后复筛结果确定这两种化合物具有体外抗肝纤维化的活性。详见2，图 2-2、2-3。
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284

【参考文献】