白藜芦醇抑制内皮细胞炎症和促进自噬耦联效应的分子机制研究

发布时间：2020-04-16 05:06

【摘要】：血管慢性炎症是动脉粥样硬化过程中的主要病理改变,然而其发生机制尚不完全清楚。ox-LDL是动脉粥样硬化的危险因素,能够损伤内皮细胞参与动脉粥样硬化的发生进展。白藜芦醇是一种多酚类物质,具有抗氧化、抗炎症等多种作用。本课题重点观察了白藜芦醇对ox-LDL刺激内皮细胞TLR活化、MMPs表达以及自噬的影响,分析了白藜芦醇抑制炎症改善细胞功能的分子机制。本研究使用人脐静脉内皮细胞作为研究对象,用ox-LDL或LPS处理内皮细胞,用WesternBlot,免疫荧光和ELISA方法检测蛋白的表达和分泌。动物实验观察小鼠体重和血脂成分、免疫组化观察血管结构、TLR4表达,ELISA测定血浆MMPs含量。TLR4是天然免疫性受体,外来刺激以及内源性有害产物聚集均可诱导TLR4活化发生炎症反应。金属蛋白酶(Metalloproteinases)是一类依赖于锌、钙离子的蛋白水解酶,具有分解细胞外基质的作用。二者均参与动脉粥样硬化进展。结果显示,ox-LDL或LPS刺激内皮细胞均增加了 TLR4表达。并增加了金属蛋白酶MMP-3、MMP-9的表达,白藜芦醇有效地抑制了这一反应。ELSIA结果显示白藜芦醇降低了 ox-LDL和LPS刺激细胞MMP-3和MMP-9分泌。对分子机制的研究表明,白藜芦醇抑制了 ox-LDL或LPS刺激的转录因子STAT3的磷酸化;STAT3抑制剂也抑制了 MMP-3、MMP-9的表达;提示STAT3是白藜芦醇作用的重要靶点。其次,我们观察了 ox-LDL和白藜芦醇对Sirt1/AMPK通道的影响。Sirt1是参与细胞能量代谢的长寿因子。结果显示,ox-LDL或LPS刺激内皮细胞Sirt1表达下降,AMPK磷酸化水平降低,而白藜芦醇处理逆转了这一现象。第二信使分子cAMP和cGMP产生是被AMPK调控的,白藜芦醇处理也增加细胞内cAMP和cGMP含量。此外,我们进一步分析了 ox-LDL和白藜芦醇对细胞自噬功能的影响。自噬增强是细胞的保护性行为,mTOR是自噬信号的上游分子,具有抑制自噬的作用。结果表明,ox-LDL刺激内皮细胞增加了 mTOR磷酸化,白藜芦醇处理抑制了其磷酸化,并增加了自噬标志蛋白LC31I、Atg5和Atg7的表达。动物实验观察了白藜芦醇对高脂饮食小鼠血浆MMP-3、MMP-9、血管结构和TLR4表达。结果显示,与高脂饮食组相比,白藜芦醇处理降低了小鼠血浆总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C),高密度脂蛋白胆固醇(HDI-C)含量,也降低了血浆MMP-9含量,对MMP-3无显著影响。天狼星染色显示,高脂饮食组小鼠血管结构紊乱,胶原成分减少,胶原之间的空隙增多。白藜芦醇给药干预组小鼠血管胶原排列规则,与正常对照组相似。免疫组化TLR4染色发现,高脂饮食组小鼠血管壁TLR4表达明显高于对照组和白藜芦醇处理组。这些结果提示白藜芦醇对长期高脂饮食引起的血管病变具有保护作用。结论:白藜芦醇能够抑制ox-LDL刺激内皮细胞TLR4介导的MMP-3和MMP-9表达和分泌,其分子机制与抑制转录因子STAT3活化相关。白藜芦醇能够增加Sirt1/AMPK通道活化,增加细胞cAMP、cGMP水平。此外,白藜芦醇能够促进细胞自噬,对ox-LDL诱导的内皮细胞损伤具有保护作用。体内实验也表明白藜芦醇能够降低高脂饮食小鼠血管TLR4表达,降低血浆MMP-9含量,对于血管结构损伤具有保护作用。
【图文】：

且具有浓度依赖性。白藜芦醇（１、１０、１００邋ＨＭ）以剂量依赖的方式抑制了邋ｏｘ－ＬＤＬ逡逑诱导的内皮细胞ＴＬＲ４表达。此外，通过免疫荧光分析了邋ＴＬＲ４表达情况，显示逡逑ｏｘ－ＬＤＬ组ＴＬＲ４表达明显增加，，白藜芦醇逆转了这一现象（图１）逡逑Ａ逦Ｂ逡逑ｏｘ－ＬＤＬ邋（０．１邋ｍｇ邋ｉｎｉ）逦－逦＋逦＋逦＋逦＋逡逑ｏｘ－ＬＤＬ邋（ｍｇ／ｍｌ）邋０逦０．０２逦０．０５逦０．１逦０．２邋Ｒｃｓｖｃｒａｔｒｏｌ邋（＾Ｍ）逦０逦０逦１逦１０逦１００逡逑ＴＬＲ４邋ｆｍｍｍ邋ｍｍ邋ｍｍ逦ｍｍ逦ＴＬＲ４逡逑（３－ａｃｔ邋ｉｎ邋ｗ逦ｐ－ａｃｔｉｎ逦ｍｍｍｍｍｍｍｍｒｎｍｍｍｍｍｍｍ逡逑｜邋１．５－，逦＊逦＊＊逦｜邋丨料逡逑ｊｊｎｉｌｉｌ逦ｉｉｌｎｉｉｉｉ逡逑／ｗｗ逦／邋／邋／邋／邋／逡逑々夕０邋０逦、、令、彳、逡逑ＴＬＲ４逦ＤＡＰＩ逦Ｍｅｒｇｅ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑１００邋ｊｉＭ邋Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ逡逑＋邋０．１邋ｍｇ邋ｍｌ邋ｏｘ－ＬＤＬ逡逑图１白藜芦醇对ｏｘ－ＬＤＬ

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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285

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本文编号：2629418