雷公藤新多苷毒性评价及其主要物质基础研究
发布时间：2020-04-17 21:33
【摘要】：目的:改变雷公藤多苷化学组分含量,获得对肾病综合征有持效减毒作用的雷公藤新多苷,对其进行体内外毒性评价、制备工艺优化以及主要成分物质基础研究,为雷公藤新多苷的临床应用提供依据。方法:据前期课题组研究,经过化学组分含量改变的雷公藤新多苷对肾病综合征有持效作用。主要是雷公藤多苷含有的WLL03有类似雷公藤内酯醇的功效。本实验将对雷公藤新多苷的毒性及以活性为导向的物质基础进行以下研究:1.WLL03的制备采用炮制的方法,将雷公藤内酯醇在磷酸缓冲溶液中水解生成WLL03。再经制备液相色谱法纯化获得。2.雷公藤新多苷的制备采用炮制的方法,对雷公藤多苷进行整体炮制,将雷公藤多苷中的雷公藤内酯醇转化为WLL03,并再补加一定比例的WLL03,组成若干组雷公藤新多苷,并测定各组雷公藤新多苷中雷公藤内酯醇及WLL03的含量。3.雷公藤新多苷细胞毒性实验通过MTT法、CCK8比色法测定多种细胞24 h、48 h的存活率,研究WLL03、雷公藤内酯醇及各组雷公藤新多苷的毒性效应。4.雷公藤新多苷动物急毒实验采用小鼠急性毒性实验方法(LD50实验),一天内给小鼠较大剂量药物(雷公藤多苷、雷公藤新多苷Ⅱ、Ⅳ),观察小鼠急性症状,记录体重变化及累积死亡数。为雷公藤的实验研究及临床安全使用提供实验依据5.WLL03的初步药代动力学实验采用LC-MS/MS法,在选择性离子对监测(MRM)下,检测WLL03在SD大鼠的药代动力学参数及生物利用度的评价。结果:1.雷公藤内酯醇经化学炮制获得WLL03,其分离提取率约为20%。2.在课题组前期基础上,获得雷公藤新多苷Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ。雷公藤新多苷Ⅱ、Ⅳ、V中雷公藤内酯醇的含量分别为:232.34±2.01μg/g、439.97±2.24μg/g、232.82± 1.93 μg/g,WLL03的含量分别为:2380.29 μg/g、2322.13 μg/g、20589.03 μg/g。WLL03细胞毒性极小,24h的IC50值分别为:HK-2(21919.73±1024.03 ug/mL)、HL-7702(9427.67 ±334.77 ug/mL)、GC-1(303862.92 ±9502.51 ug/mL)、GC-2(76578.35 ±1627.39 ug/mL)、TM4(5562.77 ± 194.13 ug/mL)、足细胞(142.72±5.32 ug/mL),48 h的IC50值分别为:HK-2(10581.12±906.26 ug/mL)、HL-7702(1561.46±99.24 ug/mL)、GC-1(353.79± 16.60 ug/mL)、GC-2(4300.40±264.90 ug/mL)、TM4(4224.97± 133.39 ug/mL)、足细胞(220.06±0.13 ug/mL)。各组药物对细胞的毒性效应总体趋势由小到大依次为:WLL03、雷公藤新多苷V、雷公藤新多苷Ⅱ、雷公藤新多苷Ⅳ、雷公藤多苷、雷公藤内酯醇。3.雷公藤多苷的小鼠半数致死量LD50为571.52 mg/kg,95%可信限为(486.78-682.51 mg/kg)雷公藤新多苷Ⅱ的最大剂量为2400 mg/kg,死亡率为1.67%,相当于人日用最大量的1600倍,雷公藤新多苷V的最大剂量为620 mg/kg,相当于人日用量的413.33倍,死亡率为16.67%。4.WLL03的离子对为377.2→217.1,在0.975ng/mL-1000ng/mL内,线性关系良好(r=0.9939),提取回收率大于89%。WLL03和内标有较大质谱峰和较好的分离度,空白血浆检测时有干扰,经多方原因排除,猜测其干扰主要来于提取过程受到污染,同时发现大鼠饲料有377分子离子。结论:经前期实验表明,湖南千金协力药业有限公司生产的雷公藤多苷可作为本实验药物来源,经过炮制后补加定量WLL03,获得雷公藤新多苷Ⅱ、雷公藤新多苷Ⅳ、雷公藤新多苷Ⅴ。细胞实验表明,WLL03毒性小或无毒性,结合动物毒性实验表明,经过炮制改变雷公藤多苷组内含量获得雷公藤新多苷Ⅱ,其毒性比雷公藤多苷、雷公藤新多苷Ⅳ更小,并且具有统计学意义。
【图文】：
逑２．邋３．邋１邋ＷＬＬ０３邋的制备逡逑将制备溶液在“２．邋２．邋１．邋３”项的条件下制备，ＷＬＬ０３洗脱液的收集范围如图２，红逡逑线到绿线之间。杂质洗脱液收集范围从１６邋ｍｉｎ－２０ｍｉｎ，其余时间段导入废液瓶。将收逡逑集的ＷＬＬ０３洗脱液于旋转蒸发仪上挥千溶剂，加少量甲醇溶解，小心转移至ＥＰ管中，逡逑以氮气吹干仪常温下吹干样品，，精密称重。逡逑ＤＡＤｌＡ．＆ｇ＝：１９．：邋Ｒｓｆ＝ｏｆｆ３Ｄ．ＶＷＬＬ－￡ＪＧＴ＼ＤＡＴＡ＼ＺＢ－ＬＧＴＳＣ－２０１６－０６－二４＊邋２Ｓ－１５＼ＣＣ：：－Ｃａ２．Ｄ；ｉ逡逑ｉ逡逑１邋１逡逑１２００逡逑１０００邋丨逦Ｉ逡逑？逦ｉ逡逑６００逦ＷＬＬ０３邋收集区域逦ｉｆ逡逑４０0邋ｌ逦＾逦逦杂质收集区域逡逑２００逦＿逦＼邋｜逦？逦＼邋务丨逡逑°逦５逦１０逦１５逦２０逦＇逦２５逡逑图２邋ＷＬＬ０３洗脱液自动收集的图谱逡逑２．邋３．邋２邋ＷＬＬ０３的纯度检g义先≈票傅模祝蹋蹋埃呈柿浚邮柿考状既芙猓咚倮胄墓埃澹玻插澹穑砺四ぃ校眨校蹋缅义洗慷燃觳忮义仙字海拢牛儒澹樱瑁椋澹欤溴澹遥校保稿澹ǎ玻保兀保埃板危保罚ǎ椋恚涣鞫啵阂译妫逑担惶蒎义隙认赐眩赐殉绦蚣恚常涣魉伲海埃冲澹恚蹋恚椋睿患觳獠ǔぃ海玻保梗插澹睿睿椋恢拢海常
本文编号：2631320
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