巴天酸模提取物抗金黄色葡萄球菌和Ⅱ型单纯疱疹病毒研究

发布时间：2020-04-18 06:54

【摘要】：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是一种适应性强、普遍存在的病原菌,能在各种极端恶劣的环境中存活,并在人和动物中引起广泛的感染。由金黄色葡萄球菌引起的化脓性炎症、肺炎和菌血症是对公众健康的严重威胁,尤其是在医院手术期间。据世界卫生组织统计,全世界每年有超过1500万人感染金黄色葡萄球菌。一旦被金黄色葡萄球菌感染,治疗的主要方法就是使用抗生素。不幸的是,这种细菌已经具备了抗药性,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)已经成为临床治疗中最困难的问题之一。目前,还没有经过批准的针对金黄色葡萄球菌的疫苗,并且由于细菌的毒性因子比较复杂,导致细菌疫苗的设计也面临着巨大的挑战。因此,迫切需要开发新的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌药物。II型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV-2)是包膜双链DNA病毒,是一种通过性传播导致生殖器疱疹的主要原因,同时也是导致宫颈癌和人类免疫缺陷病的主要原因,反复发作,很难治愈。目前还没有用于治疗HSV-2感染的疫苗,而且常规使用的合成核苷类似物已经导致了耐药性的出现。因此,研发新的抗HSV-2的药物是迫切需要的。近年来天然产物的应用已经成为一大热点,主要原因为其分布广泛、简便易得、价格低廉等。中草药作为具有抗菌、抗病毒疗效的天然产物,在东亚地区已经被使用了几千年,而中草药在治疗病毒感染方面应用也比较广泛,且效果显著,因此,天然产物是寻找抗菌、抗病毒药物的丰富资源。巴天酸模(Rumex patientia L.,R.patientia L.),隶属于双子叶植物纲蓼目蓼科酸模属,多年生草本植物,主要产自北温带。近年来,酸模属植物因其抗肿瘤、抗菌、抗病毒等显著的治疗作用而引起人们的广泛关注。截止到目前为止,关于酸模属植物化学成分的研究报道很少,目前只分离到少数化合物,如:蒽醌、黄酮、萘和二苯乙烯。本研究中我们以巴天酸模根为研究对象,研究了其对金黄色葡萄球菌的抑菌作用,以及对HSV-2病毒的抗病毒作用,并对其机理开展了初步研究。本论文研究主要包括以下几个部分:(1)巴天酸模抗菌及抗病毒活性筛选。确定巴天酸模提取物的最佳提取方式,即乙醇提取;筛选抑菌效果最好的菌株,即金黄色葡萄球菌;筛选抗病毒效果最好的毒株,即HSV-2病毒。通过液-液萃取法对巴天酸模醇提取物进行分离,成功获得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取样品。(2)巴天酸模提取物抑制金黄色葡萄球菌活性研究。测定巴天酸模醇提取物对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度(MIC)为10 mg/m L,并且体外杀菌效果显著,正丁醇萃取样品对金黄色葡萄球菌抑菌效果最好,MIC值为2.5 mg/m L,体外杀菌效果显著。初步探索了其抑菌机制,发现主要原因是巴天酸模提取物破坏了金黄色葡萄球菌的细胞壁和细胞膜结构,抑制了金黄色葡萄球菌的粘液分泌,抑制了Hla蛋白介导的溶血作用,促进了金黄色葡萄球菌细胞聚集,并且可能与金黄色葡萄球菌DNA沟槽结合,扰乱了金黄色葡萄球菌正常的生理机能功能,从而导致其死亡。(3)巴天酸模提取物抗HSV-2病毒活性研究。细胞水平上证明巴天酸模醇提取物对HSV-2病毒有较好的抗病毒活性,其主要方式为对HSV-2的直接灭活作用,通过构建动物模型发现,巴天酸模提取物可以显著提高被攻毒动物的存活率,实验黏膜组给药存活率较PBS组提高28.57%,且临床发病症状明显好转。同样正丁醇萃取样品抗HSV-2效果最好,0.25 mg/m L正丁醇萃取样品对病毒的抑制率达95%,通过构建攻毒动物模型发现,2 mg/kg黏膜组给药存活率较PBS组提高50%,且临床症状明显好转。初步研究了其抗HSV-2病毒机制,发现巴天酸模提取物主要破坏了HSV-2病毒的核酸及VP5蛋白结构。(4)巴天酸模提取物的毒性评价。通过MTT方法确定其细胞毒性,当醇提取物浓度低于1.25 mg/m L时细胞毒性小于50%,0.5 mg/m L正丁醇萃取样品对VERO细胞毒性较小,低于50%。通过急性毒理实验证明醇提取物给药浓度低于25 mg/kg时对小鼠正常生理活动没有影响,为给药安全浓度,低于50 mg/kg时为正丁醇萃取样品给药安全浓度。通过本论文的研究,发现巴天酸模提取物可作为一种抑菌和抗病毒药物来源,为今后针对耐药性细菌以及耐药性病毒新药研究奠定了一定的基础。
【图文】：

路线图,实验设计,路线,内容

（1）首先在细胞水平上研究了醇提取物对HSV-2 的作用阶段，然后摸索HSV-2 攻毒剂量，进行动物保护性实验。（2）选取不同有机溶剂萃取样品通过MTT方法检测细胞水平上抗HSV-2 效果，通过结果分析抗病毒活性成分主要位于在正丁醇萃取层，之后用正丁醇萃取样品进行动物水平抗病毒实验。（3）巴天酸模醇提取物初步抗病毒机理研究：通过核酸和蛋白电泳发现巴天酸模醇提取物对HSV-2 的核酸和VP5 蛋白具有破坏作用。4、巴天酸模提取物细胞毒性及动物毒性评价（1）细胞毒性评价：选取犬肾细胞（MDCK）、非洲绿猴肾细胞（VERO）、TZM-B1、人恶性胚胎横纹肌瘤细胞（RD）四种细胞通过MTT实验检测巴天酸模醇提取物的细胞毒性。各有机层萃取样品通过VERO细胞进行检测。（2）动物毒性评价：分别用不同浓度醇提取物和正丁醇萃取样品，连续腹腔给药 7 天，观察Balb/c小鼠存活率以及体重摄食变化等。

流程图,巴天酸模,水提取物,流程图

图 2.1 巴天酸模水提取物流程图提取（冷浸法）取 100 g巴天酸模植物根，加入 3 倍体积无水乙醇，，多功能搅拌机搅8h，超声仪超声破碎 30 min（功率 38%，on 5 s/off 5 s，冰浴），6将得到的滤液 12000 rpm离心 30 min，上清 50℃旋转蒸发仪浓缩至膏状物用DMSO溶解，过 0.22 μm滤膜过滤除菌，4℃保存，流程图如
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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