绞股蓝皂苷单体gypenoside LI和miR-128-3p对黑色素瘤增殖的影响

发布时间：2020-04-23 11:51

【摘要】：黑色素瘤是由黑色素细胞过度增殖引发的皮肤肿瘤,恶性程度比较高,易转移,预后差且死亡率比较高。目前主要的临床治疗手段有:手术、化疗、免疫疗法和靶向治疗,但治疗效果仍然不理想。所以其发病率也是近年来增长较快的恶性肿瘤之一。目前已经上市的治疗黑色素瘤的药物有威罗菲尼、达拉菲尼、曲美替尼、替莫唑胺、白细胞介素-2等。绞股蓝是一种多年生的草质藤本植物,主要活性物质为绞股蓝皂苷,目前已知的功效有抗炎、保肝、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤作用,此外还具有降低血脂、防治心脑血管疾病及免疫调节的作用。Gypenoside LI是一种绞股蓝皂苷单体,其药理作用尚未见报道。尽管研究表明绞股蓝总皂苷具有抗肿瘤的功能,但是目前还没有研究报道绞股蓝皂苷单体gypenoside LI诱导黑色素瘤细胞凋亡。因此,探究gypenoside LI对黑色素瘤的作用尤为重要。miRNA是在真核生物中发现的一类内源性非编码RNA,长度为18-24bp,其作用机制是与靶基因的3'-UTR结合,降低靶基因mRNA的稳定性,抑制靶蛋白的合成,从而在细胞增殖、分化、发育和凋亡中起重要作用。大量数据表明miRNA在众多肿瘤中都存在异常表达,而这一发现可应用于临床诊断和治疗。有文献报道miR-128-3p在肺癌、肝癌、淋巴性白血病等癌症中有异常表达,而在黑色素瘤中是否存在这一现象并未见报道。因此,本课题将探究miR-128-3p对黑色素瘤增殖的影响及其调控机制。研究目的:探究gypenoside LI对A375和SK-MEL-28黑色素瘤细胞系的抑制作用;研究gypenoside LI是否通过Wnt/β-catenin信号通路抑制A375和SK-MEL-28细胞的增殖;探讨黑色素瘤细胞中miR-128-3p的表达情况;研究miR-128-3p对黑色素瘤细胞增殖的影响;探讨miR-128-3p影响黑色素瘤细胞增殖作用的分子机制。方法1:cck-8检测gypenoside LI和Cisplatin对HaCat、A375和SK-MEL-28细胞的毒性作用;Gypenoside LI在IC_(50)药物浓度下作用于黑色素瘤细胞系24 h的形态学观察;AV/PI凋亡检测gypenoside LI诱导黑色素瘤细胞的凋亡情况;流式细胞术检测gypenoside LI对A375、SK-MEL-28周期的影响;细胞集落实验检测gypenoside LI对A375、SK-MEL-28单个细胞的增殖能力;Western blot检测gypenoside LI对凋亡相关蛋白(PARP、Caspase 9、BID、FLIP、Bcl-2),周期相关蛋白(CDK2、p-CDK2),Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白(β-catenin、DVl-2、Cyclin D1)及细胞因子IL-24蛋白表达的影响。方法2:qPCR检测miR-128-3p在人正常永生化表皮细胞HaCat和黑色素瘤A375细胞中的表达情况;cck-8检测miR-128-3p对A375细胞增殖的影响;miR-128-3p对HaCat、A375细胞集落和迁移(Transwell实验、细胞划痕实验)的影响;TargetScan软件预测miR-128-3p的靶基因;转染miR-128-3p后,Western blot检测HaCat和A375细胞靶蛋白的表达情况及与细胞增殖等相关蛋白的表达情况。结果1:cck-8检测gypenoside LI作用于A375细胞的IC_(50)为75μg/mL,SK-MEL-28细胞的IC_(50)为29.71μg/mL;细胞形态学观察给药处理24 h后细胞凋亡成时间依赖性发生;流式细胞仪检测A375细胞中处理组早期凋亡率为45.3%,对照组为6.5%,早期凋亡率远高于未处理组;流式细胞周期检测实验表明gypenoside LI将A375、SK-MEL-28细胞阻滞在S期;同时,细胞集落实验表明gypenoside LI能够抑制黑色素瘤单个细胞的增殖能力;Western blot结果显示,给药处理组凋亡蛋白PARP、Caspase 9、BID的剪切条带表达量较对照组明显增加,FLIP、Bcl-2较对照组表达量减少;处理组的周期相关蛋白CDK2、p-CDK2与对照组相比表达量明显减少;Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、DVl-2、Cyclin D1的蛋白表达量也减少;而IL-24蛋白表达量与对照组相比增多。结果2:qPCR检测结果为miR-128-3p在HaCat细胞中高表达,而在黑色素瘤A375细胞中低表达;cck-8数据显示过表达miR-128-3p模拟物后可抑制A375细胞的增殖;转染miR-128-3p inhibitor后,HaCat细胞与对照组相比细胞集落数目成浓度梯度增多,细胞迁移率(Transwell、划痕实验)成浓度梯度增大;过表达miR-128-3p后,A375细胞与对照组相比集落数目成浓度梯度减少,细胞迁移率(Transwell、划痕实验)也成浓度梯度减小;而与细胞迁移有关的蛋白MMP2、MMP9表达量在下调miR-128-3p的正常株HaCat细胞中表达增多,而在过表达miR-128-3p的黑色素瘤A375细胞株中表达量减少;TargetScan软件预测到与细胞增殖相关的基因DVL2和CDC6为miR-128-3p的靶基因;下调miR-128-3p后,Western blot结果显示HaCat细胞中DVl-2、Cdc6蛋白高表达,而过表达miR-128-3p后的A375细胞中DVl-2、Cdc6蛋白表达量减少;与Wnt/β-catenin信号通路有关的β-catenin蛋白在下调miR-128-3p的HaCat细胞中表达量增多,而在过表达miR-128-3p的A375细胞中表达量减少;与周期相关的CDK2在转染miR-128-3p inhibitor的HaCat细胞中表达增多,相反,在过表达miR-128-3p的A375细胞中表达减少。结论:1.Gypenoside LI可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来抑制黑色素瘤细胞的增殖,它可以将细胞阻滞在S期并诱导细胞凋亡。2.miR-128-3p通过调控DVL2、CDC6基因的表达抑制黑色素瘤细胞的增殖。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285

【参考文献】