黄连碱抗肝癌及对急性肝损伤保护作用的初步研究

发布时间：2020-04-26 07:12

【摘要】：黄连是我国传统名贵中药材之一,是毛茛科植物黄连、三角叶黄连、云南黄连的干燥根茎。黄连性寒,味苦,具有清热燥湿,泻火解毒的功效,具有历史悠久,来源和药用价值广泛的特点。近年来,随着中医药与医学技术的发展,黄连越来越多的药理作用被展示出来了。研究证明,黄连具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗癌、抗氧化、降血压、降血脂、降血糖、抗血小板聚集和改善心脑血管疾病等药理活性。黄连含多种异喹啉类生物碱,主要由小檗碱、黄连碱、巴马汀、表小檗碱、非洲防己碱和药根碱组成,其中小檗碱含量最多。目前,小檗碱作为广泛的研究对象,已有许多药理功效被发现,但其他生物碱还需要深入研究,而黄连碱和小檗碱有相同的母体结构,且两者结构差异小。肝细胞癌是世界上最常见和最具有侵袭性的恶性肿瘤之一,而其分子发生机制尚不明确。许多研究表明miR-122是一种肝特异性microRNA,占约肝脏总microRNA的70%,是一种抑癌基因,通常在肝癌中表达下调。因此,本研究建立荷人肝癌细胞株HepG2的BALB/c雄性裸鼠移植瘤模型,初步研究黄连碱的抗肝癌活性及其作用机制;并研究了黄连碱对内毒素和D-氨基半乳糖造成的急性肝损伤的肝预防保护作用。本研究的内容和结构如下:⑴黄连碱安全性。对处于对数期生长状况良好的HepG2、Huh7和L02细胞进行MTT实验,检测不同浓度的黄连碱对细胞毒性的影响,实验结果显示黄连碱具有选择性诱导HepG2、Huh7细胞凋亡而对正常细胞无细胞毒性。当药物浓度达到25μg/mL时,HepG2和Huh7细胞成活率低于80%,但对L02细胞没有明显毒性,但当药物浓度达到300μg/mL时,L02细胞的成活率低于80%。所以,黄连碱是一种低毒的安全化合物且具有肝保护作用。HepG2、Huh7和L02细胞IC_(50)值分别为47.056μg/mL、61.831μg/mL和329.265μg/mL。⑵黄连碱抗肝癌活性体外实验:在细胞实验方面,主要检测黄连碱对HepG2和Huh7细胞增殖能力、迁徙能力的抑制,对凋亡和miR-122表达的影响。分别通过MTT法和集落形成实验,划痕愈合实验,Hoechst 33258和流式细胞术,RT-qPCR检测相关指标。实验结果显示,HepG2细胞24h的黄连碱IC_(50)值为47.056μg/mL,Huh7细胞的黄连碱IC_(50)值为61.831μg/mL,黄连碱对HepG2的增殖抑制效果更强;并且,25μg/mL浓度的黄连碱在7d后完全抑制HepG2细胞的增殖并且致全部细胞死亡。25μg/mL的黄连碱有效的抑制HepG2、Huh7细胞和转染miR-122模拟物的HepG2细胞的迁移。黄连碱可诱导肝癌细胞的凋亡。⑶黄连碱抗肝癌活性体内实验:将处于对数生长期且具有95%存活率的人HepG2细胞,皮下接瘤于4周龄的BALB/c雄性裸鼠的右肩胛部位。实验随机分为空白对照组、模型组、阳性药物组(索拉菲尼,120.13mg/kg)以及黄连碱高剂量组(150mg/kg)。接种后裸鼠随机分组,每组8只,裸鼠的肿瘤体积每5天测量一次,为期30天。索拉菲尼和黄连碱溶于超纯水,药物组成瘤后每只每日一次按体重进行成灌胃,模型组灌等体积的生理盐水。通过HE染色分析裸鼠肝脏和肿瘤的组织病理学变化,Western blot和RT-qPCR分别检测肝脏和肿瘤的相关蛋白的表达变化、miR-122表达水平的变化,并且监测裸鼠的肿瘤体积的变化,体重变化,肝、肾、脾与体重重量的变化。实验结果表明,与模型组相比,黄连碱组与索拉菲尼组均能抑制肿瘤的生长(P0.01)并且两者之间差异没有达到显著性。黄连碱提高了裸鼠肝脏miR-122的表达水平。无论从肉眼直接观察还是从HE染色结果,均显示了黄连碱有保护肝脏的效果;脏体比进一步展示出黄连碱的低毒害功效。⑷黄连碱肝保护作用体外实验:通过MTT法筛选出合适的内毒素(LPS)浓度、黄连碱浓度以及两者共作用的浓度在HepG2、L02细胞进行后续实验以及建立肝损伤细胞模型。以及观测内毒素和黄连碱对HepG2、L02细胞72h生存率的影响。并通过PT-qPCR检测了miR-122的变化。通过流式细胞术检测了转染miR-122模拟物和miR-122抑制物及其相关对照物后的HepG2、L02细胞的凋亡率的变化。用蛋白免疫印迹法检测HepG2、L02细胞中相关凋亡蛋白的表达的。实验结果表明当内毒素达到10μg/mL即可建立细胞的肝损伤模型。黄连碱对肝细胞具有选择性的保护作用,对HepG2细胞毒性大,但对L02细胞毒性小。黄连碱使HepG2细胞miR-122的表达下调,使L02细胞miR-122的表达上调。黄连碱促进HepG2细胞凋亡,相反,通过抑制凋亡来保护L02细胞。⑸黄连碱肝保护作用体内实验:4周龄的雄性昆明小鼠随机分为空白对照组,模型组,黄连碱低剂量组(37.5mg/kg),黄连碱高剂量组(150mg/kg),每组10只小鼠。药物组进行每只每日一次进行灌胃,连续7天,最后一次灌胃1h后用内毒素(500ug/kg)/D氨基半乳糖(400mg/kg)混合液进行腹腔注射诱导急性肝损伤模型。检测血清的AST、ALT,肝组织匀浆的GSH、SOD变化。RT-qPCR检测肝组织的miR-122变化。HE染色分析肝脏的形态结构变化,免疫组化分析相关凋亡蛋白的变化。实验结果显示,内毒素和D氨基半乳糖导致了肝脏的凋亡,但黄连碱有着上调GSH、SOD、miR-122和下调AST、ALT的能力,黄连碱在急性肝损伤实验中有预防保护作用。总之,通过上述实验,表明黄连碱对肝癌细胞有抑制增殖、迁移和促进凋亡的作用,并且在裸鼠中通过上调miR-122来抑制肿瘤的生长和在急性肝损伤中保护肝脏作用。
【图文】：

黄连碱,存活率,细胞,成活率

第 3 章黄连碱的安全性评价选择性诱导 HepG2、Huh7 细胞凋亡而对正常细胞无细胞毒性。当药物浓度达到 25 μg，HepG2 和 Huh7 细胞成活率低于 80%，但对 L02 细胞没有明显毒性（图 3-1），物浓度达到 300 μg/mL（图 3-2）时，L02 细胞的成活率低于 80%。所以，黄连碱是毒的安全化合物且具有肝保护作用。HepG2、Huh7 和 L02 细胞 IC50值分别为 47/mL、61.831μg/mL 和 329.265μg/mL。

黄连碱,存活率,黄连,不良反应

图 3-2 黄连碱对 L02 细胞存活率的影响Figure3-2 Effects of Coptisine on L02 cellsviability cells treated with COP at concentrations range from 0 to 500 μg/mL for 24h. The data were shown asD with relative optical density values at 490 nm or counted using a hemocytometer in three dueriments. (*p < 0.05 and**p < 0.01 vs controlgroup).5 讨论与小结植物提取物通常因为有着微小的副作用而被认为是安全无害的[87]。临床上黄连常不良反应主要集中在消化系统（如腹泻），常规应用黄连饮片而引起不良反应的情，，不良反应常与个体的体制，既往病史，过敏史，服用药物的剂量与方式等因素有黄连注射液可引起过敏性休克，黄连忌与菊花等性寒之物配伍，脾胃虚弱的人也不连，黄连也不得长时间服用[88,89]。本研究中，细胞的安全用量通过 MTT 法来选择
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】