积雪草酸及穿心莲内酯靶向线粒体抵御神经退行性疾病的作用及相关机制研究

发布时间：2020-04-26 09:36

【摘要】：背景业已表明,氧化应激、线粒体缺陷以及炎症反应参与神经退行性疾病的发生过程,例如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)和帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等。AD的典型病理学特征为患者脑内出现老年斑(senile plaques,SP)、脑神经纤维样缠结(neurofibrillary tangles,NFT)及选择性神经细胞死亡。脑内老年斑内沉积的主要是Aβ蛋白(Amyloid beta protein)。与PD相关的α-synuclein蛋白(α-syn),是Lewy小体的主要组份。细胞内α-syn的过表达可导致线粒体氧自由基的过量产生和线粒体结构与功能异常。在AD、PD发病过程中,线粒体损伤是重要环节,而靶向线粒体的神经保护机制鲜有报道。积雪草酸(asiatic acid,AA)是积雪草的提取物,系五环三萜烯类化合物,具有清除自由基和保护线粒体之功效,可防治抑郁症。我们以前的研究发现,AA还具有神经保护作用,但其机制仍待进一步研究。穿心莲内酯(Andrographolide),是穿心莲的主要活性成分,其可通过抑制肿瘤细胞周期和凋亡,具有抗瘤活性,还能对抗氧化应激、改善小鼠糖尿病性痴呆。此外,在APP/PS1老年痴呆小鼠,穿心莲内酯能够保护突触的可塑性,促进长时程增强(longterm potentiation,LTP)抑制长时程抑制(longterm depression,LTD),改善AD症状,并通过活化Wnt促进APP/PS1小鼠神经元再生,抑制GSK-3β缓解了神经退行性疾病,然而其机制却不详。目的鉴于氧化应激、线粒体功能紊乱和炎症是AD和PD发生的重要因素,保护线粒体、缓解氧化应激和抑制炎症对防治此类疾病具有重要意义。我们前期的研究表明,积雪草酸及穿心莲内酯都可以对线粒体有一定保护作用,积雪草酸可以通过稳定线粒体膜电位来保护线粒体,穿心莲内酯可通过诱导线粒体自噬而保护线粒体稳态、抑制非可控性炎症时炎症小体的活化;穿心莲内酯还能够清除活性氧(Reactive oxygen species,ROS),保护大鼠脑线粒体,或通过抑制小胶质细胞炎症反应保护脑缺血再灌注大鼠神经元细胞。在此基础上,本论文拟通过建立AD、PD在体和离体模型,应用积雪草酸等药物进行干预,借此分析积雪草酸及穿心莲内酯在改善AD、PD症状中的作用,探讨通过保护神经元细胞线粒体和抑制小胶质细胞活化来防治AD、PD的可能性,从线粒体水平揭示神经退行性疾病发生的可能机制,寻找合适的干预靶点。方法1、线粒体缺陷细胞氧化损伤模型的诱导:使用叠氮钠(Sodium Azide,Na N3)作为线粒体电子传递链细胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase,COX)的特异性抑制剂,以鱼藤酮(Rotenone)作为线粒体呼吸传递链复合物Ⅰ的抑制剂,再联合使用H2O2诱导线粒体缺陷的神经细胞氧化损伤;直接应用Aβ损伤细胞,模拟AD、PD时线粒体缺陷神经细胞经过度氧化刺激下,引发特定脑区神经细胞损伤的过程。2、细胞活性和线粒体功能的分析:细胞活性检测采用MTT法;通过显微镜观察细胞的形态学;流式细胞仪分析线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)的变化。综合应用上述方法观察该模型中神经细胞内线粒体的变化,及AA和穿心莲内酯调控线粒体、保护神经元和调控小胶质细胞炎症的作用。(1)在叠氮钠、鱼藤酮等诱导的线粒体轻度损伤模型(模拟AD、PD早期)中,用Mitotracker red荧光染料分析线粒体数目,DCFHDA荧光染料检测ROS的生成,接着用MTT法检测AA对急性鱼藤酮损伤的细胞存活率的影响。此外,在叠氮钠诱导的AD细胞模型中,还检测了线粒体膜电位,加入AA后检测同样指标,以评价AA神经保护作用的线粒体机制。(2)在PD离体实验中,以鱼藤酮损伤SH-SY5Y细胞为模型,通过检测细胞存活率和凋亡,探讨穿心莲内酯对鱼藤酮损伤的抵抗作用。检测指标包括:氧化应激和线粒体膜电位、线粒体耗氧、ATP含量和线粒体形态等。大致过程为:以不同浓度的穿心莲内酯处理SH-SY5Y细胞3 h,加入30μmol/L Rotenone作用6 h,MTT法检测细胞的活性;Annexin-V/PI双染检测细胞凋亡率;DCFH-DA染色分析细胞内ROS;JC-1染色观察细胞线粒体膜电位的改变;荧光素酶法检测ATP的含量;Clark氧电极检测线粒体的呼吸功能;应用MDA和SOD试剂盒测定细胞MDA和SOD的含量,以分析细胞氧化应激。此外,用Mito Tracker green染色作流式细胞分析,检测线粒体数目变化。通过上述分析,探讨穿心莲内酯对线粒体损伤的保护和维持线粒体形态的机制。3、小鼠PD样模型的建立及行为观察:采用MPTP构建PD样小鼠模型,分析穿心莲内酯对PD模型鼠行为改善的影响。首先采用开场试验、悬挂试验、爬杆试验、强迫游泳试验和转轮试验检测小鼠的行为变化,继而取中脑组织检测氧化应激指标、炎症反应、细胞凋亡和线粒体拷贝数,以探讨穿心莲内酯改善PD模型鼠运动行为的相关机制。(1)小鼠帕金森病建模:连续5天腹腔注射25 mg/kg MPTP进行模型诱导,干预组在诱模的同时腹腔注射2.5 mg/kg和5 mg/kg穿心莲内酯,连续12天。(2)小鼠在体试验:采用开场试验、爬杆试验、转轮试验、强迫游泳、悬挂试验观察小鼠运动行为的改变。采用Western Blot和免疫组化法分析黑质区酪氨酸羟化酶的表达;Nissl染色法检测脑蛋白合成功能;用MDA、SOD和Catalase试剂盒分析小鼠黑质部氧化应激水平;用TUNEL染色法检测小鼠黑质部神经元凋亡情况;以ELISA检测外周血炎症因子的表达水平;quantity Real-time PCR测定小鼠脑区炎症因子的m RNA表达水平;免疫荧光染色法检测小胶质细胞活化标志Iba-1。(3)在离体试验中:以不同浓度的穿心莲内酯处理SH-SY5Y细胞3 h后,加入30μmol/L Rotenone作用6 h,用MTT法检测细胞活性;Annexin-V/PI双染法分析细胞凋亡率;DCFH-DA染色法检测细胞内ROS;JC-1染色分析细胞线粒体膜电位的变化;荧光素酶法分析ATP含量;Clark氧电极检测线粒体呼吸功能。此外,MDA和SOD试剂盒分析细胞MDA、SOD含量,以了解细胞氧化应激。Mito Tracker green染色后流式细胞分析技术检测线粒体数目,quantity Real-time PCR分析线粒体拷贝数的变化。4、在AD模型中:用不同浓度(1、10、100 nmol/L)的AA预处理SH-SY5Y细胞24h,然后加入Aβ1-42(10μmol/L)作用24 h诱导细胞损伤,建立细胞模型。采用MTT法检测细胞活性,流式细胞分析和Hoechst 33342染色检测细胞凋亡,JC-1染色法观察线粒体膜电位,荧光素酶法检测细胞内ATP含量。此外,我们观察了AA对PD果蝇攀爬能力和寿命的影响,检测了AA对PD果蝇体内MDA和GSH的水平的影响。结果1.SH-SY5Y细胞氧化应激损伤和线粒体损伤模型的建立。结果表明,对于SH-SY5Y细胞,H2O2、鱼藤酮和叠氮钠浓度分别达300μmol/L、10 nmol/L和15 mmol/L时开始产生明显损伤,且在一定范围内,损伤的程度与药物呈剂量依赖关系。形态学观察也显示,随着药物浓度的增加,SH-SY5Y细胞的形态发生明显改变,表现为从突起减少到消失、胞体皱缩等。2.AA对鱼藤酮诱导的PD样细胞损伤具有明显的干预作用。(1)AA可通过稳定线粒体的膜电位发挥神经保护作用。在鱼藤酮损伤的细胞中,加入AA能对抗线粒体膜电位的去极化和ROS的增加、抑制BAX的上调。应用本研究分别建立的SH-SY5Y细胞氧化应激损伤和线粒体损伤模型,初步观察了AA的神经保护作用。结果表明,在H2O2刺激SH-SY5Y细胞前24 h,给予不同剂量的AA可抵抗300μmol/L H2O2对细胞的损伤。另外,AA也可对抗Na N3或Na N3+H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤。流式细胞仪分析线粒体膜电位发现,AA可减缓损伤细胞线粒体膜电位的下降。这一结果提示,AA的神经保护作用机制可能与稳定线粒体的膜电位有关。(2)AA通过抑制α-syn过表达、线粒体转位和Cyto C释放,下调ROS和BAX等发挥线粒体保护作用。在鱼藤酮诱导的线粒体损伤模型:0.01 100 nmol/L AA可影响100 nmol/L鱼藤酮诱导的PD样细胞损伤。AA可对抗鱼藤酮损伤的细胞线粒体膜电位去极化和ROS增加,抑制BAX的上调。在α-syn过表达的PD果蝇模型:0.5-2 mg AA/100g培养基能显著提高果蝇的攀爬能力,延长其寿命,PD果蝇体内MDA含量明显降低,GSH含量显著升高,这可能与AA抗氧化作用有关。在α-syn诱导的离体小鼠脑线粒体损伤模型:AA能逆转α-syn引起的线粒体膜电位的下降,稳定膜的完整性和ATP的合成,抑制ROS的产生和细胞凋亡。AA的保护作用与其阻止α-syn线粒体转位相关。此外,在小鼠帕金森病模型中,我们发现穿心莲内酯可改善PD样小鼠的运动功能,表现为给药后能提高PD样小鼠在开场试验中的运动距离和在中心区域活动时间,缩短爬杆时间和延长转轮平衡时间,提高强迫游泳时PD样小鼠运动协调能力以及悬挂试验中的抓握能力。同时,能够改善黑质部分氧化应激水平和炎症因子表达水平。结论本研究应用AD、PD模型检测了线粒体功能、Cyto C和α-syn的表达,探讨AA或穿心莲内酯对抗Aβ、α-syn或MPTP诱导神经损伤的线粒体机制,积雪草酸可通过调控线粒体介导的细胞凋亡、保护线粒体功能和增加线粒体数目等作用对抗叠氮钠和Aβ1-42诱导的细胞损伤。穿心莲内酯具有保护线粒体对抗氧化应激的作用,显示其治疗PD的潜力。研究结果提示,线粒体在AD、PD发病过程中具有重要作用,以线粒体为靶向的药物AA及穿心莲内酯可作为防治AD、PD的候选药物,有进一步研发的价值。线粒体可以作为研究神经退行性疾病机制的一个重要靶点,为抗氧化及炎症因子损伤、保护神经细胞、调控小胶质细胞功能,预防PD和AD提供新的研究思路。
【图文】：

线粒体功能,假说,级联

线粒体功能的级联假说[46]

机制,氧化应激

PD发生的机制[74]
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

【参考文献】