黄芪注射液对LPS诱导的C57小鼠全身性炎症中脑损伤的保护作用

发布时间：2020-04-27 11:58

【摘要】：背景严重的全身性炎症造成的多器官损伤中,神经系统并发症可以造成比炎症本身和其他器官损伤更为复杂的情况,而严重的病变更会导致不可逆的病残甚至死亡。黄芪广泛应用于高血压、心脑血管疾病、糖尿病及其并发症、肾病综合症等疾病治疗。研究表明黄芪注射液有增强心肌收缩力,增加冠状血流量,保护心肌细胞、以及改善心血管功能。而其对全身性炎症脑损伤的保护作用研究尚未见报道。本论文探讨了黄芪注射液对LPS诱导的C57小鼠全身性炎症脑损伤的保护作用,同时进一步研究了黄芪注射液是否基于对miR-155的调控,影响其下游信号,改变脑屏障结构部分蛋白表达,从而保护脑屏障结构与功能。研究结果可为黄芪注射液防治LPS所致的脑血管炎性相关疾病提供实验依据。本研究得到了国家自然科学基金面上项目(NSFC-8107308-4、NSFC-No.81572678)和中央高校学生项目(XDJK2017D154)的支持。目的1.观察黄芪注射液对LPS诱导产生的小鼠全身性炎症损伤的保护作用,从整体的角度明确黄芪注射液是否对LPS诱导产生的全身性炎症脑损伤有保护作用。2.观察黄芪注射液对LPS诱导产生的小鼠全身性炎症损伤6天、17天认知功能行为学的影响,从行为学角度观测黄芪注射液对全身性炎症脑损伤的保护效应。3.观测黄芪注射液对LPS诱导产生的小鼠全身性炎症脑损伤血脑屏障结构和功能的影响,基于其对miR-155及下游靶基因的调控,进一步探讨黄芪注射液保护血脑屏障的可能机制。方法1.采用LPS(2 mg/kg)连续三天腹腔注射制备小鼠全身性炎症模型,分为正常对照、模型组(LPS)、阳性对照(地塞米松,30 mg/kg)组,黄芪注射液低、中、高剂量(1、5、10 mL/kg,相当于原药材2、10、20 g/kg)组。于LPS给药前三天开始连续给药17天,每日一次。分别于第6天、第17天观测:(1)小鼠摄水摄食量、体温、体重等评价黄芪注射液对小鼠生存状态的改善;(2)小鼠脑、心、肝、脾、肺、肾重量,评价黄芪注射液对小鼠脏器指数的影响;(3)HE染色、尼氏染色观察黄芪注射液对LPS致炎小鼠脑组织病理变化的影响。2.采用旷场实验(Open-field test)、新物体识别实验(New object recognition task),评测黄芪注射液对小鼠LPS损伤后认知功能的影响。3.采用经心脏灌注Evans Blue(EB),检测脑组织EB渗漏到血管外程度;透射电镜观测血脑屏障超微结构;免疫荧光双标技术观测紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1、Occludin分别与血小板-内皮细胞黏附分子CD31在内皮细胞上的共表达,从形态结构上观测黄芪注射液对LPS致血脑屏障损伤的保护作用。4.采用qPCR检测Claudin-5、ZO-1、Occludin、α-actinin1、Vinculin、cateninα1、mir-155-5p及其下游基因mRNA的表达;利用WB检测紧密连接蛋白Claudin-5、ZO-1、Occludin和RhoA、ROCK2信号通路相关蛋白的表达,初步探讨黄芪注射液对脑损伤后血脑屏障保护的可能机制。结果1.黄芪注射液改善LPS致小鼠炎性综合征状态,减轻LPS造成的脑组织损伤黄芪注射液显著改善LPS造成的体重下降、摄食摄水量减少、体温下降,降低死亡率,升高存活率;减轻LPS造成的脑组织损伤,减少LPS造成的炎细胞浸润、神经元肿胀和神经元坏死;第6天时,黄芪注射液降低LPS造成的脑、心、肺脏器指数上升,第17天时各组小鼠各个脏器指数均恢复。2.黄芪注射液逆转LPS致小鼠认知行为能力下降与正常组相比,LPS连续给药3天后,模型组小鼠的爬行格数、直立次数均显著下降(P0.01);在第17天时,模型组小鼠新物体识别系数显著降低(P0.05),爬行格数仍显著下降(P0.001),直立次数减少,修饰次数、粪便粒数、中央格停留时间增加。与模型组相比,黄芪注射液10 g/kg剂量组新物体识别系数显著升高(P0.05),地塞米松能显著升高小鼠的爬行格数(P0.01),直立次数、修饰次数增加,粪便粒数、中央格停留时间减少。3.黄芪注射液保护LPS致血脑屏障损伤模型组C57小鼠脑组织蓝染严重,皮质区红色荧光信号强,脑组织有大量EB渗漏,黄芪注射液减少脑组织EB渗漏。电镜结果显示黄芪注射液10 g/kg剂量组明显拮抗LPS所致的星形胶质细胞肿胀、内皮细胞连接开放。4.黄芪注射液拮抗LPS致脑血管内皮细胞之间紧密连接的表达qPCR结果显示:第6天时,与正常组相比,LPS组降低Claudin-5(P0.01)、α-actinin1(P0.01)、Vinculin(P0.01)、cateninα1(P0.01)、Rho(P0.01)、ROCK2(P0.01)、mir-155-5p(P0.001)的表达,升高SHIP1(P0.001)、BCL6(P0.01)mRNA的表达;与模型组比较,黄芪注射液10 g/kg升高ZO-1(P0.001)、α-actinin1(P0.05)、Vinculin(P0.05)、cateninα1(P0.001)、ROCK2(P0.05)、PKCβ(P0.05)、mir-155-5p(P0.001)的表达,降低Claudin-5(P0.001)、Rho(P0.05)、RhoA、SHIP1(P0.001)、BCL6(P0.001)、SOCS1(P0.001)mRNA的表达。第17天时,与正常组相比,LPS组降低Claudin-5(P0.01)、Vinculin(P0.01)、cateninα1(P0.01)、mir-155-5p(P0.001)的表达,升高RhoA(P0.05)、PKCβ(P0.01)mRNA的表达;与模型组相比,黄芪注射液10 g/kg升高Claudin-5(P0.001)、α-actinin1(P0.05)、Vinculin(P0.01)、cateninα1(P0.05)、BCL6(P0.001)、mir-155-5p(P0.01)mRNA的表达,降低Rho(P0.05)、RhoA(P0.01)、PKCβ(P0.05)、SHIP1(P0.05)mRNA的表达。WB结果显示,与正常组相比,第6天时,LPS损伤后显著降低了小鼠脑组织中Claudin-5、ZO-1、Occludin、ROCK2蛋白的表达(P0.01),黄芪注射液10 g/kg升高LPS所致的Occludin、ZO-1、Claudin-5、RhoA、ROCK2蛋白表达下降。第17天时,LPS可显著降低RhoA蛋白的表达(P0.05),黄芪注射液10 g/kg能显著升高LPS造成的RhoA、ZO-1蛋白表达下降(P0.05),显著降低LPS造成的ROCK2蛋白表达下降(P0.01)。结论黄芪注射液改善LPS所致的全身性炎症损伤,改善LPS所致的认知功能下降,逆转血脑屏障结构和功能的破坏,其保护机制可能是通过mir-155-5p上调脑血管内皮细胞间连接蛋白的表达,继而保护全身炎症所致的血脑屏障破坏。
【图文】：

给药方案

图 1 给药方案示意Fig 1. Indication of dosage plan2.3 体重、饮水、饮食、存活率及体温监测每天早上 9：00 对 C57 小鼠进行体重、饮水、饮食测量，记录数据。每 12 h 对小鼠存活状态进行观察。于 LPS 第一次给药后的 0 min、15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h 进行肛温测定，记录数据。2.4 体态及脏器指数观察于 LPS 第三次给药后 1 h 拍照记录 C57 小鼠体态情况并进行比对；6 d、17 d 小鼠取材前进行称重，，脱颈处死后分别取大脑（切去嗅球和小脑）、心、肝、脾、肺、肾，生理盐水冲洗，去除筋膜，滤纸吸干水分，称重。C57 小鼠体重记为 M，脏器重记为 m，计算脏器指数 f=m/M。2.5 石蜡切片与 HE 染色2.5.1 组织石蜡包埋切片

黄芪注射液,体态,小鼠,地塞米松

西南大学硕士学位论文如图 2 所示，LPS 给药后，与正常组相比，模型组小鼠活动量减少，弓背明显，肛周异物堵塞较多，提示动物身体状况下降；与模型组相比，地塞米松组小鼠活动增多，弓背现象得到改善，肛周无异物堵塞，提示地塞米松对 LPS 所致的炎症有保护作用；与模型组相比，黄芪注射液各剂量组小鼠活动增多，弓背现象得到改善，肛周异物堵塞减少，提示黄芪注射液对 LPS 所致的炎症有保护作用。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】