【摘要】：研究背景功能性消化不良(Functional dyspepsia,FD)是临床中最为常见的功能性胃肠病之一,其典型临床症状包括上腹痛、饱胀感、早饱、恶心等,影响患者的生活质量。根据罗马IV标准,FD分为两个亚型:餐后不适综合征(Postprandial discomfort syndrome,PDS)和上腹痛综合征(Epigastric pain syndromeEPS),PDS的临床症状主要为饱腹感和早饱感,EPS主要表现为上腹痛或灼痛,在临床中,二者可单独出现,也可重叠发生。内脏高敏感是FD重要的发病机制之一。内脏高敏感形成的机制复杂,最终结果通常导致内脏传入神经元和脊髓背角神经元的敏化,或脊髓伤害感受神经元的下行兴奋和抑制作用发生障碍,导致生理性刺激感受阈值降低和对伤害性感觉刺激反应强烈。这些机制有可能独立存在或相互作用,最终促进了内脏高敏感的发生。内脏高敏感的诱发因素有多种,包括机械刺激、近端十二指肠化学刺激、低温、心理精神因素等。机械刺激诱导一直是FD内脏高敏的研究热点。胃肠道内存在多种机械敏感细胞,如肠嗜铬细胞(Enterochromaffin cells,EC)、内在和外在肠神经元细胞、平滑肌细胞和Cajal间质细胞等,可感知并传递机械刺激信号。近年来,肠嗜铬细胞表面存在的多种机械敏感性离子通道被一一研究和揭示,EC细胞作为胃肠道重要的机械感知细胞,对胃肠道正常生理功能的行使具有重要作用。与此同时,EC细胞是血清素释放的主要来源之一,而机械刺激导致的血清素异常释放可诱导内脏高敏的发生。有关EC细胞机械敏感性离子通道或受体与血清素释放的关系尚未完全明了,以此为切入点研究FD内脏高敏的发生机制具有重要的意义。目前,FD的治疗主要以对症治疗为主,促动力药、抑酸药和抗抑郁药被广泛应用,但是效果单一,且易反复发作。中医药在整体调节的基础上显示了其在治疗FD方面的优势。脾虚证是FD最常见的基础证型,香砂六君子汤作为治疗FD脾虚证的经典代表方药,具有健脾和胃,理气消胀的作用,不仅仅可提高胃肠动力,在治疗胃痛胃胀,改善内脏高敏感现象中也具有良好功效。香砂六君子汤在降低内脏高敏中的机制尚不明确,本研究将从EC细胞机械敏感性离子通道的角度入手,研究香砂六君子汤对其影响,探讨香砂六君子汤在内脏高敏感发生机制中的作用。第一部分PIEZO2离子通道在FD患者胃底黏膜组织中表达情况的研究研究目的明确PIEZO2在胃底黏膜层EC细胞中的表达情况。研究方法收集FD患者和正常人胃底黏膜组织,进行免疫荧光染色和WB检测,观察EC细胞和PIEZO2蛋白在FD患者和正常人胃底组织黏膜层中的表达情况。研究结果EC细胞和PIEZO2皆主要存在于黏膜层中。与正常人相比,FD患者胃底黏膜层EC细胞和PIEZO2表达量均增多。研究结论1人胃底组织黏膜层中存在PIEZO2的表达。2较之正常人,FD内脏高敏患者胃底黏膜层的PIEZO2、EC细胞和5-HT表达量较高。第二部分QGP-1细胞机械力刺激模型的建立及抑制剂干预对QGP-1释放5-HT的影响研究目的采用EC细胞模型QGP-1细胞,分析在机械力刺激中,EC细胞释放5-HT与PIEZO2离子通道和EPAC1信号通路的关系。研究方法1将QGP-1细胞接种在Flexcell应力加载系统中,使用牵张机械应力和压力机械应力分别干预细胞,观察细胞分泌5-HT的情况,确立5-HT释放情况的量效曲线,计算出5-HT最大释放量时的刺激时间。2分别用PIEZO2抑制剂GsMTx4、EPAC1特异性拮抗剂ESI-09干预细胞,检测细胞5-HT释放量和胞内钙离子浓度。研究结果1对QGP-1细胞采取循环拉伸应力刺激和恒定压力应力刺激,在不同时间点收集的细胞上清液,分析5-HT含量。拉伸刺激作用于细胞120s以后,培养上清中5-HT含量基本趋于稳定;在压力刺激作用于细胞150s以后,培养上清中5-HT含量基本趋于稳定。2拉伸应力刺激后,与对照组5-HT浓度相比,阳性对照KC1组和拉伸组的5-HT浓度显著升高(P0.05),两抑制剂组的5-HT浓度显著降低(P0.05);与KC1组相比,拉伸组和两抑制剂组5-HT浓度显著减低(P0.05);与拉伸组相比,两抑制剂组5-HT浓度显著降低(P0.05);而GsMTx-4组与ESI-09组两两对比,组间无显著差异。3压力应力刺激后,与对照组相比,阳性对照KCl组与压力组的5-HT浓度显著升高(P0.05),GsMTx-4组与ESI-09组的5-HT浓度显著降低(P0.05);与KCl组相比,压力组和各抑制剂组5-HT浓度皆显著降低(P0.05);与压力组相比,GsMTx-4组与ESI-09组的5-HT浓度显著降低(P0.05);两抑制剂组组间对比差异不显著。4机械应力刺激后,与对照组相比,各组钙离子浓度皆显著升高(P0.05)。与KCl组相比,各组细胞内钙离子浓度皆显著降低(P0.05)。拉伸组、压力组、GsMTx-4各组与ESI-09各组,组间对比无差异;与拉伸组相比,GsMTx-4组与ESI-09组钙离子浓度显著降低(P0.05);与压力组相比,GsMTx-4组与ESI-09组钙离子浓度显著降低(P0.05)。研究结论1QGP-1细胞可以作为模拟EC细胞的模型。2EPAC1参与PIEZO2介导的机械信号转导,协同使得胞内钙离子水平升高,最终导致5-HT的释放。第三部分FD病证结合大鼠模型的建立及香砂六君子汤的干预机制研究研究目的以FD脾虚证大鼠模型为依托,观测香砂六君子汤对EPAC1-PIEZO2轴及各相关指标的影响,研究香砂六君子汤降低内脏高敏感的机制。研究方法1采用碘乙酰胺叠加小平台站立法建立FD脾虚证内脏高敏感模型。2从模型大鼠一般情况、体重、饮水量和进食量、VFH纤维实验、抓力、糖水偏好、血清乳酸、D-木糖、淀粉酶含量测定实验对模型大鼠进行评价。3从体重、饮水量和进食量、VFH纤维实验、抓力、血清乳酸、D-木糖、淀粉酶含量测定实验和病理组织切片染色观察香砂六君子汤对模型大鼠的影响。4使用WB方法测定各组大鼠胃底黏膜组织EPAC1蛋白和PIEZO2蛋白含量,使用Elisa方法测定胃底黏膜组织中5-HT、cAMP、钙离子浓度含量。研究结果1与对照组相比,病证结合模型组大鼠的体重显著降低、进食和饮水量、痛阈值、抓力、血清D-木糖含量和淀粉酶含量显著降低(P0.05);血清乳酸浓度增加,差异有统计学意义(P0.05)。2中药干预后,与对照组相比,病证结合模型组、中药高、中、低剂量组大鼠体重均显著降低(P0.05),但与阳性药物氟西汀组相比,中药高、中剂量组体重无显著差异。与对照组相比,病证结合模型组、中药低剂量组的进食量依旧显著减少(P0.05)。与对照组相比,病证结合模型组、氟西汀组、中药高、中、低剂量组饮水量仍旧显著减少(P0.05)。与对照组相比,病证结合模型组、中药中、低剂量组的痛阈值依旧显著降低(P0.05)。与对照组相比,病证结合模型组大鼠抓力依旧显著降低(P0.05),其他各组与对照组相比无显著差异。给药后,各组大鼠血清D-木糖、淀粉酶含量显著升高(P0.05),乳酸含量显著降低(P0.05),与对照组相比,组间无显著差异。HE染色显示,各组大鼠胃底黏膜完整,形态正常,未见明显充血、水肿或糜烂、溃疡。3病症结合模型组大鼠5-HT、cAMP水平较之对照组普遍显著升高(P0.05),中药干预后,各指标趋于恢复正常水平。与病证结合模型组相比,中药高、中剂量组大鼠胃底黏膜的EPAC1蛋白、中药高剂量组PIEZO2蛋白表达量显著降低(P0.05);与疾病模型组相比,中药中剂量组大鼠胃底黏膜组织中5-HT含量显著减少(P0.05),与氟西汀组类似。研究结论1碘乙酰胺灌胃是经典的制作内脏高敏感大鼠模型的造模方法。碘乙酰胺叠加小平台站立是建立FD脾虚证大鼠模型的良好造模方法。3香砂六君子汤可通过EPAC1-PIEZO2轴干预EC细胞5-HT的释放,从而降低内脏高敏感的程度,其中以香砂六君子汤中剂量效果最优。
【图文】：
基丁？邋ＥＰＡＣ１－Ｐ丨ＥＺ０２轴探讨ＥＣ在ＦＤ内脏高敏感中的作用及香砂六]Y子汤的十侦研究荧光组织观察逡逑置于共聚焦激光扫描显微镜下观察和拍摄图片。ＦＩＴＣ激发波长是４９５０５－５６５ｎｍ；邋ＴＲＩＴＣ激发波长是５４３，发射波长是５０５－５６５ｎｍ；邋ＤＡ发射波长是４８８。逡逑结果逡逑ＨＥ染色结果逡逑下，对ＦＤ患者和正常人的胃底组织病理切片分别进行了观察。可以织情况皆为良好？＿胃黏膜结构较为完整，未见炎症细胞浸润？，腺体，未见充血、水肿、糜烂或溃疡表现；黏膜下血管清晰。逡逑ＦＤ患者逦正常人逡逑
逦逡逑ＦＤ患者逦正常人逡逑■■逡逑图２ＦＤ患者与正常人ＥＣ细胞免疫荧光表现（ＭＯＯ，邋ｂａｒ＝２５ｕｍ）逡逑３逦ＥＣ细胞－ＰＩＥＺ０２免疫荧光共定位逡逑共聚焦显微镜下，５－ＨＴ阳性表达为红色荧光染色，ＰＩＥＺ０２阳性表达为绿色荧光染逡逑色。与正常人相比，，ＦＤ患者胃底黏膜层ＰＩＥＺ０２阳性细胞增多。且ＥＣ细胞和ＰＩＥＺ０２逡逑可共定位。逡逑
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
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本文编号：
2643881
