Notch信号通路在寻常型银屑病发病中的机制研究以及龙胆泻肝汤加减对其的干预作用

发布时间：2020-04-30 02:17

【摘要】：目的:1.探讨Notch信号通路对HaCaT细胞(人永生化角质形成细胞系)增殖和分化的影响;2.分析Notch信号通路在银屑病皮损区皮肤组织中的表达情况;3.评价龙胆泻肝汤加减对豚鼠银屑病样皮损Notchl、Jaggedl和Hes-1表达的影响。方法:1.以角质形成细胞HaCaT细胞为研究对象,分别采用MTT法、流式细胞技术、Western blot技术检测Notch信号通路激活剂(Jaggedl-Fc融合蛋白)和Notch信号通路抑制剂(DAPT)对HaCaT细胞增殖、凋亡和分化的影响。2.采用实时荧光定量RT-PCR技术和Western blot技术检测银屑病患者皮损区皮肤组织Notchl、Jaggedl和Hes-lmRNA和蛋白的表达情况。3.选取80只豚鼠,用5%普萘洛尔乳剂外涂豚鼠耳背制备银屑病样病理改变模型,设置空白组、模型组、西药对照组、成药对照组及龙胆泻肝汤加减低、中、高剂量治疗组,行普通病理切片HE染色检测皮损病理改变Baker评分及炎症细胞浸润情况;免疫组化技术检测皮损组织Notchl、Jaggedl和Hes-1在细胞中的表达情况。结果:1.MTT结果显示,与对照组相比,Jaggedl-Fc融合蛋白处理组的吸光度值明显增高(P0.05),表明Jaggedl-Fc融合蛋白能够明显促进HaCaT细胞增殖。流式细胞术结果显示,Jaggedl-Fc融合蛋白处理组的细胞凋亡率为4.76±1.13,显著低于对照组(13.69±2.05)(P0.01),DAPT处理组的细胞凋亡率为26.87±3.18,与对照组相比差异显著(P0.01)。说明激活Notch信号通路能够抑制HaCaT细胞凋亡,阻断Notch信号通路能够促进HaCaT细胞凋亡。Western blot结果显示:.Jaggedl-Fc融合蛋白能够明显促进Bcl-2蛋白表达(P0.01),抑制Bax蛋白表达(P0.01);DAPT则能够明显抑制Bcl-2蛋白表达(P0.01),促进Bax蛋白表达(P0.01)。Jaggedl-Fc融合蛋白能够明显抑制Keratinl和Involucrin蛋白表达(P0.05),DAPT则能够明显促进Keratinl和Involucrin蛋白表达(P0.05)。2.患病组皮损处Notchl、Jaggedl和Hes-1 mRNA和蛋白的表达水平显著高于对照组和正常组,差异具有统计学意义(P0.01),对照组与正常组相比Notchl、Jaggedl和Hes-1 mRNA和蛋白的表达水平无显著性差异(P0.05)。提示Notch信号通路的激活与银屑病的发生密切相关。3.模型组和其余各组相比,Baker评分和炎症细胞浸润数评分均有显著性差异(P0.01),提示模型制备成功。西药对照组Barker评分和细胞浸润情况低于成药对照组(P＜0.05),西药对照组与中剂量组两者评分接近(P＞0.05),成药组与低、高剂量组情况接近(P0.05)。中剂量组与西药对照组镜下均可见角化不全、过度现象减轻,表皮突变平,棘层变薄等征象。免疫组化染色结果发现,模型组的Notchl、jaggedl和Hes-1的表达水平显著高于其他各组。龙胆泻肝汤加减中剂量组与西药对照组三种蛋白的表达量相当,且显著高于龙胆泻肝汤加减高、低剂量组与成药对照组。结论:1.Notch信号通路参与了 HaCaT细胞的增殖和分化,激活Notch信号通路能够促进HaCaT细胞的增殖、抑制HaCaT细胞的凋亡和分化。反之,阻断Notch信号通路能够抑制HaCaT细胞的增殖、促进HaCaT细胞的凋亡和分化。2.Notch信号通路参与HaCaT细胞的凋亡可能与调控Bcl-2和Bax蛋白的表达有关,Notch信号通路参与HaCaT细胞的分化可能与调控Keratinl和Involucrin蛋白表达有关。3.Notch信号通路关键因子在银屑病患者皮损区皮肤组织中表达上调,Notch信号通路的激活与银屑病的发生密切相关。4.中剂量龙胆泻肝汤加减(4.5g/kg)对银屑病的治疗效果较好,其可能是通过调控Notchl、Jaggedl和Hes-1的表达量抑制微血管生成达到治疗银屑病的目的。
【图文】：

细胞增殖,融合蛋白,信号通路

用ＳＰＳＳ２１．０统计分析软件对实验数据进行分析，定量结果用平均数士标准差逡逑（［士ｓ）表示。通过单因素方差分析来比较组间差异，以Ｐ＜０．０５，邋Ｐ＜０．０１为差异逡逑具有统计学意义。逡逑二、实验结果逡逑（？）邋Ｎｏｔｃｈ信号通路对ＨａＣａＴ细胞增殖的影响逡逑Ｊａｇｇｅｄ邋１－Ｆｃ融合蛋白能够特异性激活Ｎｏｔｃｈ信号通路，而ＤＡＰＴ对Ｎｏｔｃｈ信号通逡逑路具有阻断和抑制的作用，ＭＴＴ实验检测用ｊａｇｇｅｄｌ－Ｆｃ融合蛋白激活和用ＤＡＰＴ阻逡逑断Ｎｏｔｃｈ信号通路对ＨａＣａＴ细胞增殖的影响。结果如图１所示，，Ｊａｇｇｅｄｌ－Ｆｃ融合蛋逡逑白能够明显促进ＨａＣａＴ细胞增殖，与０卜ｉｇ／ｍｌ组相比差异显著（Ｐ＜０．０１），邋ＤＡＰＴ则逡逑能够抑制ＨａＣａＴ细胞增殖，与Ｏｐｍｏｌ／Ｌ组相比差异显著０．０５），且都具有剂量逡逑和T间依赖性。说明激活Ｎｏｔｃｈ信号迎路能够促进ＨａＣａＴ细胞增殖，阻断Ｎｏｔｃｈ信逡逑号迎路能够抑制ＨａＣａＴ细胞增殖。逡逑

细胞凋亡,融合蛋白,信号通路

逦山东中医药大学２０１７届博士学位论文（二）Ｎｏｔｃｈ信号通路对ＨａＣａＴ细胞凋亡的影响逡逑用流式细胞术检测ＤＡＰＴ和Ｊａｇｇｅｄｌ－Ｆｃ对Ｎｏｔｃｈ信号通路的影响以及对ＨａＣａＴ细胞凋亡的影响。结果如表１和图２所示，Ｊａｇｇｅｄｌ－Ｆｃ融合蛋白能够明显抑制ＨａＣａＴ细胞凋亡，与空白对照组相比差异显著（／＾〈Ｏ．Ｏｌ），ＤＡＰＴ则能够明显促进ＨａＣａ细胞凋亡，与空白对照组相比差异显著（Ｐ＜邋０．０１）。说明激活Ｎｏｔｃｈ信号通路能够制ＨａＣａＴ细胞凋亡，阻断Ｎｏｔｃｈ信号通路能够促进ＨａＣａＴ细胞凋亡。逡逑表１邋Ｊａｇｇｅｄ１－Ｆｃ融合蛋白和ＤＡＰＴ对ＨａＣａＴ细胞凋亡的影响（ｘ土ｓ，邋ｎ＝６）逡逑组别逦细胞凋亡率逡逑对照组逦１３．邋６９±２．邋０５逡逑Ｊａｇｇｅｄｌ－Ｆｃ逦４．邋７６土邋１．１３林逡逑ＤＡＰＴ逦２６．邋８７±３．邋１８林逡逑注：与对照组相比，林Ａ０．０１。逡逑对照组逦Ｊ：ｉＳ２？Ｕ－Ｆｃ逦ＤＡＰＴ逡逑ｉｏ４－逦逦１０４－逦逦１0４＂逦逦逡逑
【学位授予单位】：山东中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】