水飞蓟宾抗肿瘤及对神经元细胞保护作用机制的研究

发布时间：2020-04-30 08:08

【摘要】：水飞蓟宾是从菊科植物水飞蓟的果实及种子中提取的多酚黄酮类化合物,具有抗炎、抗肿瘤和抗氧化等作用。本文对水飞蓟宾的体外抗肿瘤活性及保护神经元细胞两方面进行了研究:主要从氧化应激角度阐述了水飞蓟宾诱导人恶性胶质瘤U251细胞凋亡的机制;以及对H_2O_2处理的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的保护作用。实验结果表明,水飞蓟宾对U251细胞增殖具有明显的抑制作用。核染色分析验证了水飞蓟宾诱导U251细胞死亡为细胞凋亡。流式细胞仪检测结果表明,水飞蓟宾作用U251细胞24 h、48 h和72 h均诱导了U251细胞凋亡,且呈时间和浓度依赖关系;同时,水飞蓟宾作用24 h后细胞内ROS水平升高,线粒体膜电位下降,并且水飞蓟宾可以造成U251细胞G2/M期和S期阻滞。Western blot结果表明,水飞蓟宾处理后上调了U251细胞内Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9表达,而Caspase-8没有被活化。当加入抗氧化剂NAC后,抑制了水飞蓟宾对U251细胞的凋亡作用。在对神经母细胞瘤的作用研究中,水飞蓟宾作用24 h对SH-SY5Y细胞活力影响较小,而200μM H_2O_2处理细胞24 h后,细胞活力接近50%,此浓度作为氧化损伤最适浓度,与模型组相比较,用50μM和100μΜ水飞蓟宾预处理SH-SY5Y细胞3 h能显著提高细胞存活率(P0.01)和减少凋亡,降低细胞内活性氧(ROS)的水平,稳定线粒体膜电位,降低了和凋亡相关Cleaved-Caspase-9和Cleaved-Caspase-3的表达。由此可见,水飞蓟宾对不同的细胞株有不同的作用,水飞蓟宾长时间处理U251细胞可以诱导凋亡和抑制增殖,而水飞蓟宾短时间处理却可以保护H_2O_2诱导的SH-SY5Y细胞损伤。水飞蓟宾诱导U251细胞凋亡可能通过造成细胞G2/M期和S期阻滞,提高细胞内ROS水平,进而通过线粒体途径来诱导人恶性胶质瘤U251细胞凋亡。而水飞蓟宾保护SH-SY5Y细胞免受H_2O_2损伤可能通过水飞蓟宾的抗氧化性和稳定线粒体膜电位,从而抑制细胞的凋亡。
【图文】：

TNFR1）是最佳特征模型，定义了细胞凋亡外在阶段的事件序列。图 1.1 以图形方式表示以上事件。图1.1 凋亡外源途径的分子机制及氧化应激调节TNFα 的关键生物学功能是通过死亡受体 TNFR1 介导的。TNFα-TNFR1 通过二硫键结合导致受体三聚化和交联，反过来释放死亡域中的抑制沉默子，这也导致 TNFR1 中相关死亡结构域（TRADD）的响应[16]。 因此，，形成复合物 I 和 II 并激活不同的下游信号传导途径，即存活或凋亡（图 1.1）。TRADD 在复合物 I 中起到受体相互作用蛋白 1（RIP1）和 TNF 受体相关因子 2（TRAF2）的支架作用。这反过来促进了 TGF-β 激酶 1 的募集和 NF-κB、Jun N-末端蛋白激酶（JNK）和 p38 的激活。与 NF-κB 活化一起，抗凋亡蛋白如 c-FLIP、Bcl-xL、X 连锁凋亡抑制剂（XIAP）和细胞凋亡抑制因子（c-IAP）1 和 2 也被激活（图 1.1）。凋亡信号调节激酶 1（ASK1）的激活与 ROS 对 c-FLIP 蛋白酶体降解和 JNK 活化有关[19]。接下来阐述复合物 II 介导的凋亡机制，复合物 II 在 TNFR1 受体内吞作用后在细胞

最终产生活性 Caspase-9 并导致细胞凋亡（图 1.1）。而 Smac/DIABLO 和HtrA2/Omi 抑制 IAP 活性，从而通过间接激活 Caspase-3 促进细胞凋亡。另一方面，AIF、EndoG 和 CAD 从线粒体释放后直接进入细胞核并切割 DNA，而与 Caspase 无任何相互作用（图 1.2）。这种机制被称为细胞晚期事件，只有在细胞凋亡后才会发生[18]。细胞色素 C 是线粒体膜间隙蛋白，被限制在线粒体内膜的外侧，与线粒体特有磷脂和心磷脂结合，它在细胞内电子传递链反应中占有重要地位。氧化应激可以促进细胞色素 C 从线粒体内释放。研究表明，心磷脂（CL）被氧化降低了其与细胞色素 C 结合的亲和力，并且还促进了线粒体内膜（IMM）上细胞色素 C 的活性[26]（图 3）。在心磷脂的存在下，细胞色素 C 显示出过氧化物酶活性。在心磷脂的复合物中，H2O2催化细胞色素 C 依赖性的心磷脂过氧化。此外，Perier 等[27]人已经证明了随着复合物 I 活性被抑制，线粒体内氧化应激增加，在膜间隙中产生 H2O2，这反过来增加了可溶性细胞色素 C的释放量，随后，这种可溶性细胞色素 C 通过线粒体膜孔释放到细胞质中。
【学位授予单位】：吉林化工学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285

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本文编号：2645563