华蟾酥毒基抑制肺癌细胞A549增殖及诱导凋亡实验研究

发布时间：2020-04-30 17:24

【摘要】：背景肺癌是世界范围内最常见的恶性疾病之一,严重威胁人类的健康,发现新型有效的安全药物是目前肺癌治疗的急迫需要和研究动力。蟾酥,是从蟾蜍的皮肤和腮腺中提取的乙醇萃取物,在我国传统的抗癌治疗中应用广泛。华蟾酥毒基(Cinobufagin,CnBu),是最新发现的从中华大蟾蜍的皮肤上提取的生物活性成分,被报道证实具有多种药理作用,是蟾酥的活性成分之一,对多种人类肿瘤细胞株有广谱细胞毒性,具有新型抗肿瘤活性。但是CnBu在人肺癌细胞的体内效应和作用机制尚未明确,相关的可行性实验非常少。目的在本实验中,我们通过体内和体外实验初步探讨CnBu在肺癌细胞中的抗癌活性及机制,旨在为CnBu的进一步临床应用提供实验依据以及参考。方法(1)使用CnBu、沙蟾毒精和蟾毒灵对人肺癌细胞系和对照细胞进行处理后,使用MTT法检测细胞活力。加入CnBu孵育24-48小时后,通过人工计数确定细胞迁移数。我们采用Transwell Boyden小室评估CnBu对A549细胞侵袭的影响。加入CnBu孵育24小时后,使用姬姆萨染色,通过人工计数定量侵袭细胞数。(2)我们应用TUNELDAPI联合染色试验试剂盒检测CnBu诱导的细胞凋亡。经测试药物处理后,使用特殊的Caspase底物及荧光法检测细胞内的Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性。荧光显微镜及线粒体特异性探针(MitoTracker Red CMXRos)分析CnBu处理后A549细胞中线粒体形态的改变。DHE荧光探针分析ROS在各组细胞内的含量,并对比加与不加ROS的清除剂NAC预处理的各组细胞的活力变化。(3)我们将A549细胞注射到雄性裸鼠右后胁,10天后,对裸鼠注射CnBu 28天。实验结束时将移植瘤切除并称重、测量尺寸;每个组织分别切片脱蜡HE染色,形态学检测及组织学观察,TUNELDAPI共染色试验检测各组肿瘤细胞切片凋亡情况;免疫荧光染色分析磷酸化p53免疫荧光成像。采用QW550图像分析软件半定量分析Ki67蛋白和磷酸化p53的表达。结果(1)结果提示,CnBu在肺癌细胞中较蟾毒灵和沙蟾毒精表现出更高的抗癌效果,IC50值范围为2.3-6.7μM。同时,CnBu比对照细胞表现出更低的毒性,IC50值为22.3μM,提示CnBu对肿瘤细胞和正常细胞有较高的选择性。CnBu同时表现出与剂量相关的阻碍A549细胞迁徙、入侵的特性。(2)此外,CnBu的处理提高肺癌细胞中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性,有效地诱导A549细胞凋亡。抗癌治疗显著激活线粒体的裂解和ROS过度产生。有趣的是,抗氧化剂的添加明显减少CnBu诱导的细胞死亡,这一结果显示ROS在CnBu诱导的细胞凋亡过程中的重要作用。(3)最后,在体内实验中,我们的结果显示CnBu的处理诱导移植瘤细胞凋亡,上调了细胞增殖的生物标志物Ki-67蛋白及磷酸化的重要抗癌因子p53蛋白的表达。这些体内实验结果进一步验证了 CnBu的抗癌功能。结论我们的研究结果显示CnBu可能通过诱导细胞凋亡及提高磷酸化的p53蛋白的表达起到抑癌作用。
【图文】：

癌细胞逦正常细胞逡逑图１－２华蟾酥毒基、蟾毒灵、蟾酥的体外抗癌活性逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ邋ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ邋ｏｆ邋Ｃｉｎｏｂｕｆａｇｉｎ邋（ＣｎＢｕ），邋Ｂｕｆａｌｉｎ邋（Ｂｕ）邋ａｎｄ逡逑Ａｒｅｎｏｂｕｆａｇｉｎ邋（ＡｒＢｕ）．逡逑２抑制肺癌细胞迁移和侵袭检测结果逡逑鉴于Ａ５４９细胞系对华蟾酥毒基的处理最为敏感，我们后续的研宄选取这逡逑一细胞系对华蟾酥毒基的作用特性及机理作进一步的研宄。首先，鉴于肺癌细逡逑胞具有转移性，，我们检测了华蟾酥毒基对肺腺癌Ａ５４９细胞转移潜能的抑制作逡逑用。我们通过细胞迁移实验（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ邋ｍｉｇｒａｔｉｏｎ邋ａｓｓａｙ）分析华蟾醉毒基对Ａ５４９逡逑细胞是否具有抗转移能力。我们首先确定在高细胞密度下（ｌｘｌＯ６／每孔），０．５｜ｉＭ逡逑２１逡逑

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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】

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本文编号：2646007