基于iTRAQ定量蛋白质组学技术分析积雪草酸抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖的潜在机制

发布时间：2020-05-04 23:36

【摘要】：目的:研究积雪草酸(AA)作用后对人肝癌SMMC-7721细胞蛋白质表达谱的影响,并对差异蛋白进行生物信息学分析,通过GO功能注释、KEGG通路富集分析和PPI差异蛋白相互作用网络图的构建,结合相应细胞功能学实验的初步验证,探讨积雪草酸抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖的作用方式及潜在机制。方法:1.以人肝癌SMMC-7721细胞为研究对象,MTT实验分析AA(20、30、40、50、60μM)作用24h后对细胞增殖的抑制作用,并计算IC_(50)值,以该浓度进行后续蛋白质组学等相关实验。2.采用体外i TRAQ标记结合纳升液相色谱串联质谱的定量蛋白质组学技术获得AA作用后的蛋白质谱数据。并利用Proteome Discoverer软件筛选差异蛋白表达谱。差异表达蛋白进行GO功能注释分析、KEGG通路富集分析,并利用Omicsbean在线软件对差异富集通路中的差异蛋白进行PPI蛋白质相互作用网络图的绘制。在此基础上进行AA抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖的作用方式与作用机制的生物信息学分析。3.采用Western blot方法对生物信息学分析所得的关键差异蛋白富集通路中的线粒体凋亡相关差异蛋白(Bax、Cyt C、Caspase-3、Cleaved Caspase-3)的表达进行验证,对m TOR-4EBP1自噬通路中相关差异蛋白(LC3-I/II、m TOR、p-m TOR、4EBP1、p-4EBP1)的表达进行验证。4.结合AA诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡相关蛋白及自噬标志蛋白的表达发生差异的结论,通过Hoechst 33342/PI双染法进行凋亡染色实验和MDC法自噬囊泡染色实验进一步明确AA诱导凋亡和自噬的产生,并联用自噬抑制剂3-MA以明确AA诱导的自噬对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的抑制作用。结果:1.AA作用24h后能够剂量依赖性地抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖,IC_(50)为37.31μM。综合考虑后,本研究选用40μM的AA浓度进行后续蛋白质组学分析等实验。2.运用i TRAQ定量蛋白质组学技术筛选40μM的AA作用24h后人肝癌SMMC-7721细胞内的差异蛋白结果显示,AA干预后引起495个表达上调的蛋白及141个表达下调的差异蛋白。生物信息学分析表明这些差异蛋白主要参与到细胞能量代谢活动中,包括氧化磷酸化通路、糖酵解/糖异生通路和果糖及甘露糖代谢通路。深入分析后发现,这些细胞代谢相关通路蛋白的表达变化可能主要是由AA诱导的线粒体凋亡和通过负调控m TOR-4EBP1通路诱导的细胞自噬而引起的,进而影响细胞的正常能量代谢活动并抑制其增殖。3.Western blot验证实验表明,40μM的AA干预后可以明显上调Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3、4EBP1和LC3-II的蛋白表达,下调Caspase-3、p-m TOR、p-4EBP1的表达,与差异蛋白生物信息学分析结果一致。提示AA可诱导人肝癌SMMC-7721细胞产生线粒体凋亡和自噬。4.对AA作用后的人肝癌SMMC-7721细胞使用Hoechst 33342/PI双染法进行凋亡染色和MDC法进行自噬囊泡染色后发现,40μM的AA可明显引起凋亡细胞数和自噬囊泡数的增加,进一步证实了AA可诱导凋亡和自噬。当40μM的AA联用自噬抑制剂3-MA时,AA对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制作用可部分消失,提示AA诱导的自噬和线粒体凋亡共同引起了肝癌细胞的增殖抑制。结论:1.积雪草酸作用于人肝癌SMMC-7721细胞24h后可以剂量依赖性的抑制细胞的体外增殖,主要表现为细胞正常能量代谢相关通路受到影响,与受到细胞凋亡和自噬相关通路差异蛋白的调控有关。2.积雪草酸可影响线粒体凋亡途径的关键蛋白的表达,诱导人肝癌SMMC-7721细胞产生凋亡,同时影响m TOR-4EBP1通路自噬相关蛋白的表达,诱导自噬抑制细胞的体外增殖。
【图文】：

同位,末端氨基,三羟基,定量信息

图 1 积雪草酸（Asiatic acid，，AA）0H48O5，2α, 3β, 23-三羟基-乌苏烷型-12-烯-28在天然活性产物的研究中具有明显细胞内的蛋白质表达变化[11]。同位合纳升液相色谱和串联质谱（Na公司研发的一种基于体外等重同位最准确的一种高通量定量蛋白质位素试剂标记多肽末端氨基或赖氨分析，使得带不同同位素标签的同子，根据报告离子的丰度可获得样处理得到蛋白质的定量信息可同时

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学技术分析积雪草酸抑制人肝癌 SMMC-7721 细胞增殖的潜在机制肝癌 SMMC-7721 细胞体外增殖活性的影示，MTT 结果显示积雪草酸（20、30、4依赖性地抑制人肝癌SMMC-7721细胞的积雪草酸抑制人肝癌 SMMC-7721 细胞胞活力下降 50%左右，积雪草酸对 SMM，同时也仍存有足够数量的细胞可以进行提取。根据 IC50值综合考虑后，本实验选 SMMC-7721 细胞 24h 进行后续的蛋白质
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285

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