基于胰岛素受体信号转导通路探讨丹瓜方含药血清对胰岛素抵抗HepG2细胞的调控作用

发布时间：2020-05-05 02:58

【摘要】：目的从胰岛素受体信号转导通路探讨丹瓜方含药血清调控胰岛素抵抗HepG2细胞糖脂代谢紊乱的作用机制,为糖尿病的基础研究及中医治疗服务。方法1、用含0.25 mmol/L软脂酸的低糖DMEM培养液体外干预诱导HepG2细胞24h建立IR模型,通过葡萄糖氧化酶法检测细胞培养液中葡萄糖残余量,计算胰岛素敏感指数验证造模是否成功。2、将实验分为5组:空白对照组、高脂组、丹瓜方1组、高糖高脂组、丹瓜方2组,根据分组情况每组给予相应诱导液体外干预24h。用葡萄糖氧化酶法检测各组细胞培养液中葡萄糖残余量并计算各组细胞糖耗量及胰岛素敏感指数,糖原试剂盒检测各组细胞糖原含量,HE染色观察各组细胞形态变化,油红O染色观察各组细胞脂质堆积情况,TC、TG试剂盒检测各组细胞TC、TG含量,qPCR法检测各组细胞InsR、IRS-1、SH2B2、IGF-1、PRKAA2和PTPN1 mRNA表达量,Western Blot法检测各组细胞InsR、IRS-1、SH2B2蛋白表达量,ELISA法检测各组细胞瘦素蛋白表达量。结果1、模型建立:用含0.25 mmol/L软脂酸的低糖DMEM培养液体外干预HepG2细胞24 h后,葡萄糖氧化酶法测定结果显示,模型组细胞葡萄糖消耗量明显降低(P0.05),胰岛素敏感性减弱(P0.05),提示IR-HepG2细胞模型成功建立。2、细胞活力:CCK8法检测结果显示,空白对照组、高脂组、丹瓜方1组、高糖高脂组、丹瓜方2组之间细胞活力无明显差异(P0.05)。3、葡萄糖消耗量与胰岛素敏感指数:与空白对照组相比,高脂组细胞葡萄糖消耗量减少(P0.05),胰岛素敏感指数降低。与高脂组相比,丹瓜方1组细胞葡萄糖消耗量增加(P0.05),胰岛素敏感指数提高(P0.05);高糖高脂组细胞葡萄糖消耗量减少(P0.05),胰岛素敏感指数降低(P0.05);与高糖高脂组相比,丹瓜方2组细胞葡萄糖消耗量增加(P0.05),胰岛素敏感指数提高(P0.05)。4、糖原含量:与空白对照组相比,高脂组细胞糖原含量减少(P0.05);与高脂组相比,丹瓜方1组细胞糖原含量增加(P0.05),高糖高脂组细胞糖原含量减少(P0.05);与高糖高脂组相比,丹瓜方2组细胞糖原含量增加(P0.05)。5、TC含量:与空白对照组相比,高脂组细胞TC含量增加(P0.05);与高脂组相比,丹瓜方1组细胞TC含量减少(P0.05),高糖高脂组细胞TC含量增加(P0.05);与高糖高脂组相比,丹瓜方2组细胞TC含量减少(P0.05)。6、TG含量:与空白对照组相比,高脂组细胞TG含量增加(P0.05);与高脂组相比,丹瓜方1组细胞TG含量减少(P0.05),高糖高脂组细胞TG含量增加(P0.05);与高糖高脂组相比,丹瓜方2组细胞TG含量减少(P0.05)。7、油红O染色:与空白对照组相比,高脂组细胞内脂滴增多;与高脂组相比,丹瓜方1组细胞内脂滴有所减少,高糖高脂组细胞内脂滴则有所增多且较为密集;与高糖高脂组比较,丹瓜方2组细胞内脂滴也相应减少。8、HE染色:与空白对照组相比,高脂组细胞出现一定程度变形、细胞质染色变浅;与高脂组相比,丹瓜方1组细胞形态有所改善、细胞质染色变浅程度减轻,高糖高脂组细胞变形程度加重、细胞质染色变浅程度也更明显;与高糖高脂组比较,丹瓜方2组细胞形态也有所改善、细胞质染色变浅程度减轻。9、qPCR:与空白对照组相比,高脂组细胞InsR、IRS-1、SH2B2、IGF-1、PRKAA2mRNA表达量降低(P0.05),PTPN1 mRNA表达量升高(P0.05)。与高脂组相比,丹瓜方1组的InsR、IRS-1、SH2B2、IGF-1 mRNA表达量升高(P0.05),PRKAA2 mRNA表达量升高(P0.05),PTPN1 mRNA表达量降低(P0.05);高糖高脂组的InsR、IRS-1、SH2B2、IGF-1 mRNA表达量降低(P0.05),PRKAA2 mRNA表达量降低(P0.05),PTPN1 mRNA表达量升高(P0.05)。与高糖高脂组相比,丹瓜方2组的InsR、IRS-1、SH2B2、IGF-1mRNA表达量升高(P0.05),PRKAA2 mRNA表达量升高(P0.05),PTPN1 mRNA表达量降低(P0.05)。10、Western Blot:与空白对照组相比,高脂组细胞InsR、IRS-1、SH2B2蛋白表达量降低(P0.05);与高脂组相比,丹瓜方1组细胞InsR、IRS-1、SH2B2蛋白表达量升高(P0.05),高糖高脂组细胞InsR、IRS-1、SH2B2蛋白表达量降低(P0.05);与高糖高脂组相比,丹瓜方2组细胞InsR、IRS-1、SH2B2蛋白表达量升高(P0.05)。11、ELISA:与空白对照组相比,高脂组细胞瘦素蛋白表达量升高(P0.05);与高脂组相比,丹瓜方1组细胞瘦素蛋白表达量降低(P0.05),高糖高脂组细胞瘦素蛋白表达量升高(P0.05);与高糖高脂组相比,丹瓜方2组细胞瘦素蛋白表达量降低(P0.05)。结论1、高糖能在高脂诱导的基础上增加HepG2细胞内糖脂代谢紊乱,加剧IR程度;2、丹瓜方含药血清能增加IR-HepG2细胞内葡萄糖消耗量及糖原含量,提高细胞胰岛素敏感性,改善糖代谢紊乱,减轻IR;3、丹瓜方含药血清能降低IR-HepG2细胞内TC、TG含量,减轻细胞内脂质堆积,改善脂代谢紊乱,修复细胞形态损伤;4、丹瓜方含药血清改善糖脂代谢紊乱、减轻IR机制可能与调节胰岛素受体信号转导通路中相关因子(InsR、IRS-1、SH2B2、IGF-1、PTPN1及瘦素蛋白)的表达有关。
【学位授予单位】：福建中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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本文编号：2649423