何首乌中二苯乙烯苷的灵芝菌转化研究

发布时间：2020-05-06 12:52

【摘要】：目的:以灵芝菌为转化菌种,建立二苯乙烯苷与灵芝菌的双向发酵体系,通过对其转化产物及代谢酶的研究确定其转化机理,同时通过细胞毒性实验对转化产物进行安全性评价,促进中药材何首乌的进一步开发利用以及为含二苯乙烯类化合物中药材的减毒研究提供示范。方法:本研究选择药食两用灵芝菌作为转化二苯乙烯苷的菌种;通过考察不同温度、转速、接种量、底物浓度及瓶装量6个因素对转化的影响,建立灵芝菌转化二苯乙烯苷的最佳发酵体系;将收集得到的发酵样品进行萃取、浓缩、干燥、复溶等前处理操作后,采用凝胶色谱法、薄层色谱法对转化产物进行分离和纯化,利用NMR及MS等技术对产物进行结构鉴定;以转化终产物为基础,选用现代仪器分析技术HPLC-DAD-MSn对转化过程中的成分变化情况进行动态监测,确定二苯乙烯苷在灵芝菌中的转化途径和物质代谢过程,推测参与生物转化的酶;制备灵芝菌酶抽提液,定位转化酶在灵芝菌胞内外的分布情况并测定其活性;在转化体系中加入转化酶抑制剂和激活剂,观察转化情况,验证转化机理;通过体外模拟转化全过程,进行转化机理的进一步验证;最后通过比较发酵前后的样品对细胞形态的影响及MTT细胞毒性实验检测发酵后样品的毒性。结果:通过单因素考察确定温度为28℃,转速为180r/min,接种量为2.5%,瓶装量为30%,底物浓度为1.5mg/mL时转化效率最高,大约36h可以转化完全,且在6～27h灵芝菌对二苯乙烯苷的转化呈线性关系;将收集的样品经凝胶色谱柱分离纯化后MS、NMR鉴定代谢终产物为对羟基苯甲醛;不同时间点样品的HPLC-DAD-MSn检测结果表明二苯乙烯苷的物质代谢过程为:1)二苯乙烯苷→苷元+葡萄糖;2)苷元→对羟基苯甲醛+2,3,5-三羟基苯甲醛。灵芝菌中参与葡萄糖苷类化合物脱糖基的酶主要是β-D-葡萄糖苷酶,而断裂二苯乙烯母核中共轭双键的关键酶是木质素过氧化物酶(Lignin Peroxidase,简称Lip.);灵芝菌的粗酶抽提液转化实验发现仅胞外酶液能转化二苯乙烯苷,且同时在胞外酶液中检测到β-D-葡萄糖苷酶及Lignin Peroxidase的活性,据此可知参与二苯乙烯苷转化的两种酶均为胞外酶;此外通过向粗酶提取液中添加Lip.专属性抑制剂(300mmol/L的氯化钠)和激活剂(10mmol/L的藜芦醇),结果表明300mmol/L的氯化钠能部分抑制其活性,而10mmol/L的藜芦醇能激活该酶活性,由此确定参与二苯乙烯苷双键断裂的酶为木质素过氧化物酶;通过在培养体系中加入底物(二苯乙烯苷)和酶系(β-D-葡萄糖苷酶和木质素过氧化物酶),检测发现产物与灵芝菌发酵产物基本一致;此外在细胞毒性实验中发现加入未发酵的二苯乙烯苷细胞形态发生改变且细胞生长抑制率高,而加入发酵后的二苯乙烯苷样品细胞形态是正常的且细胞生长抑制率明显降低,由此可见二苯乙烯苷经过发酵后能降低细胞毒性。结论:灵芝菌可以有效地降低中草药何首乌中毒性成分二苯乙烯苷,灵芝菌与二苯乙烯苷双向发酵体系的建立及其转化机理的研究为灵芝菌在中药减毒领域的研究提供了理论依据,同时也为中药双向发酵技术的减毒提供典范,为何首乌等有毒中药材的开发利用提供了有效途径。
【图文】：

１．５、２．５、３．５、４．５、５．５ｍｇ／ｍＬ，其他条件不变，发酵１２ｈ后按照２．２．２项下的逡逑操作进行前处理并采用２．２．３项下的ＨＰＬＣ检测条件对发酵液中二苯乙烯苷峰逡逑面积进行检测，二苯乙烯苷的转化率与底物浓度之间的关系见图１。逡逑４０邋？逡逑转３０邋￣邋成逡逑｜２0－邋ｆ邋＼逡逑Ｓ邋１０邋＾逦Ｔ逡逑０邋逦：逦：逦ｒ—１￣；￣＾逡逑０逦１逦２逦３逦４逦５逦６逡逑底物量（ｍｇ／ｍＬ）逡逑图１底物浓度对生物转化的影响（ｎ＝３）逡逑从图中可以看出当底物质量浓度低于１．５ｍｇ／ｍＬ时，二苯乙烯苷的转化率逡逑随底物浓度的增加而提高，说明灵芝菌能够利用二苯乙烯苷作为碳源维持其生逡逑命活动的进行；当底物浓度超过１．５ｍｇ／ｍＬ时，灵芝菌对二苯乙烯苷的转化率逡逑降低，，同时观测到发酵液中灵芝菌细胞形态发生改变，呈皱缩状态，此结果证逡逑８逡逑

生长代谢温度范围为２７？３０°Ｃ［３９］，因此本研宄在其他转化条件不变的情况下考逡逑察了温度分别为２２°Ｃ、２５°Ｃ、２８°Ｃ、３１°Ｃ、３４°Ｃ时二苯乙烯苷的转化情况，结逡逑果见图２。逡逑２０逡逑转１６逦—逡逑？邋Ｈ邋Ｔ逦ｊ逦Ｉ逦｜逦＾逡逑２２逦２５逦２８逦３１逦３４逡逑温度／°Ｃ逡逑图２发酵温度对生物转化的影响（ｎ＝３）逡逑从图中可以看出二苯乙烯苷的转化率随着温度的升高而增大，当温度升逡逑高至２８°Ｃ时转化率达到最大，温度继续升高时转化率开始下降，因此选择逡逑２８°Ｃ作为最佳的转化温度。逡逑２．３．３转速对生物转化的影响逡逑摇床的转速是影响液体发酵的一个重要的因素，转速过快易使菌丝体打逡逑碎，过慢容易造成菌丝体缺氧而生长缓慢或死亡［３９］，本研宄分别考察了逡逑１２０、１５０、１８０、２１０ｒ／ｍｉｎ的转速对二苯乙烯苷的转化率的影响，结果见图逡逑３，从图中可以看出当转速为１８０ｒ／ｍｉｎ时，二苯乙烯苷的转化率最高。逡逑９逡逑
【学位授予单位】：湖南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 穆颖;许朝晖;周暄宣;王四旺;;何首乌中提取物二苯乙烯苷神经保护作用的研究进展[J];陕西中医;2015年10期

2 高丹丹;孙孝亚;许佳佳;陈随清;;山j乙醇提取物中总黄酮与二苯乙烯类化合物分离工艺研究[J];中医学报;2015年07期

3 邓强;马仕英;庞一剑;赖永勤;杨静云;马超;李学如;;虫草真菌发酵何首乌工艺研究[J];食品与发酵科技;2015年03期

4 郭礼强;宫小明;孙军;丁葵英;王洪涛;孔静;;高效液相色谱-质谱法同时测定曲霉菌代谢物中的黄曲霉毒素及其同系物[J];分析试验室;2015年06期

5 谢炎福;韩建明;杜苗苗;张优仪;;红曲霉与何首乌双向发酵体系的探索[J];中国实验方剂学杂志;2015年08期

6 李玲;孟英才;覃双林;吴萍;;何首乌活性成分二苯乙烯苷的黑曲霉转化的研究[J];广东化工;2014年18期

7 苏小琴;李曼曼;顾宇凡;孙晶;张静;黄正;霍会霞;张倩;赵云芳;李军;屠鹏飞;;龙血竭酚类成分研究[J];中草药;2014年11期

8 韩寒冰;王明阳;马超;李海航;;HPLC-DAD和UPLC-MS/MS对蔓花生中二苯乙烯类化合物的研究[J];天然产物研究与开发;2014年05期

9 史玉霞;周洪雷;王真;张玲;郑德;黄真;孙筱林;楚新红;康和祥;;何首乌提取液益生菌发酵前后化学成分变化研究[J];山东中医药大学学报;2014年02期

10 张庆华;易炳学;;何首乌炮制研究进展[J];中国中医药信息杂志;2014年03期

相关博士学位论文 前2条

1 林龙飞;何首乌致肝损伤成分及作用机制研究[D];北京中医药大学;2016年

2 王身艳;药用真菌发酵有毒中药草乌减毒增效基础研究[D];南京中医药大学;2012年

相关硕士学位论文 前6条

1 李丹丹;3D肝毒性评价模型的建立及何首乌肝毒性机制的初步探索[D];广西医科大学;2016年

2 梁凯;虎杖中二苯乙烯苷类有效部位的提取、纯化工艺及质量控制研究[D];广西医科大学;2013年

3 吴晓峰;发酵对中药巴豆“降毒保效”效应的物质基础研究[D];南京中医药大学;2012年

4 张浩忠;肠球菌中β-D-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究[D];山东轻工业学院;2010年

5 李娅琳;何首乌中鞣质及其与二苯乙烯苷不同配比对大鼠肝脏的影响[D];陕西中医学院;2010年

6 朴淑娟;桑白皮化学成分及不同来源桑白皮中二苯乙烯苷类化合物含量测定的研究[D];沈阳药科大学;2005年

本文编号：2651290