皖南眼镜蛇毒镇痛组分外用镇痛效应初步研究

发布时间：2020-05-06 16:47

【摘要】：目的:选取皖南地区眼镜蛇蛇毒粗毒冻干粉,从中分离提纯得到镇痛活性组分(cobra venom analgesic factor,CVAF)探讨其外用镇痛的效应及可能的作用机制,并对CVAF镇痛的时间--效应关系、剂量--效应关系和CVAF用药的耐受性及成瘾性进行初步研究。方法:1.CVAF的分离纯化及分子量测定:采用SP-SephadexC-50阳离子交换层析技术和SephadexG-50分子排阻色谱分离提纯出CVAF,以SDS-PAGE凝胶电泳法进行分子量测定。2.外用凝胶制备:将提纯冻干的CVAF冻干粉,与凝胶基质和防腐处理剂配制成调节酸碱度在6.5-7.0之间的外用凝胶制剂。3.CVAF的镇痛效应实验:用完全弗氏佐剂对40只SD大鼠进行炎症模型造模,将实验分组分为5组:(1)生理盐水对照组(NS组)、(2)完全弗氏佐剂炎痛组(CFA组)、(3)双氯芬酸钠镇痛阳性对照组(CFA+SL组)、(4)氟比洛芬镇痛阳性对照组(CFA+FB组)、(5)CVAF镇痛实验组(CFA+CVAF组),分别采用热刺痛仪和机械压痛仪测定各组大鼠在用药处理后每日的热痛反应时间和压痛反应所承受的重量,比较观察眼镜蛇毒活性组分CVAF凝胶局部外用处理后对各组大鼠热痛和机械痛的影响。ELISA法检测各组大鼠脊髓匀浆中IL-1、TNF-α的含量,HE染色法观察大鼠足趾组织病理变化。4.CVAF的时间--效应实验:20只小鼠分为两组;CVAF组和NS组,测定给药前和给药后30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h的热痛反应时间,观察CVAF时间效应关系。5.CVAF的剂量--效应实验:小鼠50只,分为5组。以LD50实验证明的药物安全用药剂量范围为依据分别取1/8、1/6、1/4、1/3、1/2LD50五个剂量;即为0.08mg/Kg、0.1 mg/Kg、0.16mg/Kg、0.2mg/Kg、0.3mg/Kg,测定各组小鼠给药前及给药后2h的热痛反应时间,观察CVAF的剂量效应关系。6.CVAF的用药耐受性实验:30只小鼠,每组10只,随机分为3组,:CVAF组(0.3mg/Kg)、吗啡组(5mg/Kg)、NS(0.2ml/10g)组,选相同时间连续8天测定大鼠给药前和给药后2h后的热痛反应时间,观察其对药物的耐受性。7.CVAF用药的成瘾性实验:24只小鼠,随机分为3组,每组8只,CVAF组、吗啡组、生理盐水组,每天给药2次(9:30、14:30),共3天。CVAF组腹腔注射6次剂量为0.1、0.2、0.2、0.3、0.3、0.4mg/Kg,总剂量为1.5mg/Kg,吗啡组腹腔注射6次,6次的剂量依次为5、10、10、15、15和20mg/kg,总剂量为75mg/kg;生理盐水组:腹腔注射生理盐水,6次均为0.2ml/10g。最后一次给药后2小时腹腔注射纳洛酮6mg/kg,记录各组出现戒断症状的小鼠数量。结果:1.经SP-SephadexC-50阳离子交换层析技术和SephadexG-50分子排阻色谱两次分离后,冻干后得到皖南眼镜蛇毒镇痛活性组分干粉,SDS-PAGE电泳测定的CVAF分子量为6.5KDa。2.以CVAF制成的凝胶制剂为透明胶状物,PH为在6.5-7.0之间。3.在镇痛效应实验中,对比各组大鼠体重发现CFA组大鼠体重增长最为缓慢,NS组体重增长较稳定,而与CFA组比较CVAF镇痛组大鼠在给药后的第7日和第14日的体重差异有统计学意义(P0.05、P0.01)。从热刺痛和机械压痛实验中发现;从用药的第4天起,CVAF镇痛组的热痛阈明显高于CFA组,差异有统计学意义(P0.01);CVAF组大鼠的机械压痛阈与各组相比都有所提高,并明显高于CFA组(P0.01);检测脊髓匀浆中IL-1、TNF-α的浓度与CFA组相比浓度较低,差异有统计学意义(P0.01),在HE染色中,CFA组大鼠的炎痛爪组织水肿明显,显微镜下观察可见中性粒细胞和淋巴细胞、巨噬细胞浸润,而CVAF组大鼠足趾组织水肿明显减轻,炎性浸润相对不显著。4.测定不同时间点的热痛反应时间比较发现,CVAF从给药0.5h后开始起效(P0.05),镇痛作用一直延续到4h(P0.05),2h后热痛反应时间延长最明显,差异有统计学意义(P0.01)。5.测定不同剂量在2小时后的热痛反应时间,其中0.1mg/Kg、0.2mg/Kg剂量组的热痛反应时间与基础热痛反应时间相比均有所减少(P0.05),0.3mg/Kg剂量组与基础热痛反应相比差异有明显统计学意义(P0.01)。6.在耐受性实验中发现通过连续八天测得不同分组中各小鼠基础痛阈发现,与NS组相比较,CVAF镇痛组的基础痛阈在连续用药的第4、6、7日差异有统计学意义(P0.05)。7.成瘾性实验中发现吗啡用药组8只小鼠都出现了戒断症状及竖尾反应,而NS组和CVAF组小鼠均未出现上述反应。结论:皖南地区眼镜蛇毒活性组分CVAF相对分子量为6500Da,用其冻干粉制成的外用凝胶制剂,局部外用凝胶局部外用可提高炎痛大鼠热痛阈和机械压痛阈,其机制可能与减少炎症介质释放,抑制炎症反应有关。CVAF小鼠腹腔注射最佳剂量为0.3mg/Kg,作用2小时镇痛效果最佳,连续7天用药后未发现耐受性,连续6次给药未发现成瘾性。
【图文】：

图 1.眼镜蛇毒粗毒 SP-SephadexC-50 阳离子交换色谱图Fig.1 CVAF separation and purification peak map, Ⅶ indicates the target peak

图 1.眼镜蛇毒粗毒 SP-SephadexC-50 阳离子交换色谱图Fig.1 CVAF separation and purification peak map, Ⅶ indicates the target peak
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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本文编号：2651563