益气活血方通过Sigma-1受体抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大的研究

发布时间：2020-05-06 14:02

【摘要】：心肌肥大是启动心力衰竭的病理过程及心力衰竭发生发展的重要促进因素。集中分布于线粒体相关内质网膜上的Sigma-1受体(Sigma-1 receptor,Sig-1R)具有抗心肌肥大和心脏保护作用,可以减轻心肌肥大和功能障碍。一方面,Sig-1R可通过2型1,4,5-三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-triphate receptor type 2,IP3R2)与 2 型兰尼碱受体(ryanodine receptor type2,RyR2)调节细胞内Ca2+浓度,抑制细胞内Ca2+过载;另一方面,肌浆网向线粒体的Ca2+转运有助于线粒体ATP生成,阻止心肌细胞肥大和凋亡。因此,Sig-1R在心肌细胞肥大与凋亡中扮演者重要的角色,值得我们探索和研究。中医治疗心力衰竭的重要思路-益气活血法可以通过改善能量代谢,降低心肌细胞凋亡率、抑制心肌细胞肥大、延缓心室重构等作用来改善心力衰竭。鉴于Sig-1R在心血管系统中的重要作用,及益气活血方在治疗心力衰竭疾病中的机理研究,我们假设,益气活血方可通过对Sig-1R的调节作用,调节Ca2+转运,维持Ca2+稳态,改善线粒体的能量代谢和ATP生成,抑制心肌细胞肥大和凋亡的发生。目的:1.在培养的H9c2细胞中,通过Sig-1R小干扰RNA(small interfering ribonucleic acid,siRNA)干预,研究Sig-1R在心肌细胞肥大过程中的作用机制。2.探讨益气活血方抑制心肌细胞肥大及凋亡的作用机制,是否与Sig-1R调节Ca2+转运,改善线粒体能量代谢和细胞凋亡有关。方法:1.在培养的H9c2细胞中,用血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)刺激,通过鬼笔环肽染色,倒置显微镜拍摄并测量细胞面积,观察不同浓度AngⅡ对心肌细胞肥大的影响。2.在培养的H9c2细胞中,通过脂质体转染Sig-1R siRNA,在mRNA水平抑制Sig-1R表达。同时用益气活血方干预。细胞分为对照组[阴性对照siRNA(Negative control-siRNA,NCsiRNA)];模型组(AngⅡ10-7mol/L+NC siRNA);益气活血方组(AngⅡ 10-7mol/L+益气活血方0.1g/L+NC siRNA);益气活血方+Sig-1R组(AngⅡ 10-7mol/L+益气活血方0.1g/L+ Sig-1R siRNA基因沉默);Sig-1R组(Sig-1R siRNA基因沉默)。3.通过荧光定量PCR检测Sig-1R的mRNA水平,确定转染效率;Western Blot检测Sig-1R与IP3R2的蛋白表达水平,确定Sig-1R在心肌肥大中的作用,及益气活血方对Sig-1R表达的影响;通过鬼笔环肽染色及Tunel染色法确定心肌细胞肥大及凋亡情况;通过检测细胞内Ca2+水平、线粒体膜电位及ATP的情况,反映益气活血方对Ca2+调控及线粒体结构与功能的保护作用。结果:1.不同浓度的AngⅡ刺激H9c2细胞48h。随着AngⅡ浓度的增加,H9c2细胞面积呈增加趋势,其中Ang Ⅱ浓度为10-7mol/L时,H9c2细胞面积较对照组显著性增加(P0.05);AngⅡ浓度为10-6mol/L时,细胞面积的增加开始呈下降趋势;AngⅡ浓度为10-5mol/L时,细胞面积低于对照组(P0.05)。2.与对照组比较,模型组心肌细胞中Sig-1R mRNA的表达量有降低趋势,但差异无统计学意义;益气活血方组与模型组比较,Sig-1R mRNA表达量有升高趋势,无统计学差异;益气活血方+sig-1R siRNA组和sig-1R siRNA组与对照组比较,Sig-1R mRNA的表达量均明显降低(P0.01,P0.001);益气活血方+sig-1R siRNA组与sig-1R siRNA组比较,Sig-1R mRNA表达量有升高趋势,但无统计学差异;益气活血方+sig-1R siRNA组与益气活血方组比较,Sig-1R mRNA表达量明显降低(P0.001)。与对照组比较,模型组心肌细胞中Sig-1R的蛋白表达水平明显降低(P0.01);与模型组比较,益气活血方组Sig-1R的蛋白表达水平升高(P0.01);益气活血方+sig-1R siRNA组与益气活血方组比较,Sig-1R的蛋白表达水平明显降低(P0.001);益气活血方+sig-1R siRNA组和sig-1R siRNA组与对照组比较,Sig-1R的蛋白表达水平均明显降低(P0.001)。钙离子通道蛋白IP3R2在AngⅡ诱导后表达增加,给予益气活血方显著抑制其表达的增加(P0.01)。3.与对照组比较,模型组细胞面积明显增大(P0.01),加益气活血方干预后,与模型组比较,则显著降低(P0.01);加Sig-1R siRNA抑制Sig-1R表达后,面积与模型组比较有降低趋势,但无统计学差异。与对照组比较,模型组细胞凋亡比例明显升高(P0.01),Sig-1R siRNA组与对照组比较也出现较多凋亡(P0.05),但其凋亡比例比模型组少(P0.05);与模型组比较,加益气活血方干预后,细胞凋亡比例则出现显著降低(P0.01),转染Sig-1R siRNA抑制Sig-1R表达后,益气活血方改善凋亡的作用有所降低,但与模型组比较仍有显著性差异(P0.05)。4.模型组胞浆Ca2+含量显著升高(P0.01);加中药干预后,组胞浆Ca2+含量降低(P0.05);Sig-1R siRNA干预后胞浆Ca2+含量也有所增高,但差异无显著性。AngⅡ刺激后,与对照组比较,线粒体去极化水平明显降低(P0.05),加入益气活血方后,去极化有所改善,但无显著性差异;加入Sig-1R siRNA干预后,与对照组比较,线粒体去极化水平明显降低(P0.05),但与益气活血方组比较,线粒体去极化水平改变不明显。另外,与对照组比较,模型组与Sig-1R siRNA组ATP含量降低(P0.05);给予益气活血方后,ATP含量有增加(P0.05),增加Sig-1R siRNA干预后,细胞中ATP含量有降低趋势(P=0.090.05)。结论:1.AngⅡ 10-7mol/L刺激H9c2细胞48h,可导致心肌细胞肥大。2.AngⅡ诱导H9c2细胞肥大的作用,与Sig-1R有关;益气活血方通过Sig-1R抑制AngⅡ诱导H9c2细胞肥大。3.益气活血方可抑制Ang Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡,其机制与Sig-1R及其信号通路有关。同时,Sig-1R水平的降低可诱导心肌细胞凋亡。4.AngⅡ刺激心肌细胞肥大过程中线粒体损伤明显,益气活血方对线粒体有一定的保护作用,其机制与Sig-1R有关。
【图文】：

八叩１１浓度为１０＿７１１１0１／１时，册0２细胞面积较对照组显著性增加（八０．０５）；八叫１丨浓度为逡逑ｌ（Ｔ６ｍｏｌ／Ｌ时，细胞面积的增加开始呈下降趋势；Ａｎｇｌｌ浓度为ｌ（Ｔ５ｍｏｌ／Ｌ时，细胞面积低逡逑于对照组（巧0．邋０５）。见于表１－２，图１－３。逡逑表卜２不同浓度Ａｎｇｌｌ处理４８ｈ后的细胞平均面积（叉士Ｓ）逡逑Ａｎｇｌｌ浓度（ｍｏｌ／Ｌ）逦ｎ逦像素值（尤士Ｓ）逡逑对照组（０）逦４逦７４５９．邋４９土８８３．邋７２逡逑１０－９逦４逦８４７２．７９邋±１６５８．６２逡逑１０＂８逦４逦８９９５．８３邋±１０３２．７８逡逑１０＇７逦４逦９２６０．９６邋±１１３２．９０＊逡逑１０—６逦４逦８０６６．８９±邋１１３０．０２逡逑１ＣＴ５逦４逦６６４６．邋１８±邋１２６３．８０逡逑注：与对照组比较，＊Ｋ0．邋０５。逡逑４２逡逑

３．邋１邋ｓｉＲＮＡ邋Ｓｉｇ－１Ｒ转染时脂质体用量的筛选逡逑跟据说明书推荐用量范围，筛选最适脂质体浓度。首先用荧光标记的ｓｉＲＮＡ转染细逡逑胞，，结果如图２－１所示。脂质体７．邋５｜ｊ邋Ｌ与１０（Ｊ邋Ｌ时均有较多荧光标记的ｓｉＲＮＡ进入细逡逑胞，且组间没有明显差异。但用ＮＣ邋ｓｉＲＮＡ与Ｓｉｇ－１Ｒ邋ｓｉＲＮＡ分别转染并检测细胞内Ｓｉｇ－ＩＲ逡逑ｍＲＮＡ表达量时，发现脂质体为７．５ｐＬ，对细胞的转染效率更高，对Ｓｉｇ－１Ｒ的ｍＲＮＡ抑逡逑制作用更明显（Ｐ＜0．邋００１）。见表２－２，图２－２。逡逑■■逡逑■■逡逑图２－１不同量脂质体与荧光标记的ｓｉＲＮＡ转染细胞（２００Ｘ）逡逑注：ＡＢ分别为脂质体７．５｜ｊＬ时的明场与荧光；ＣＤ分别为脂质体ｌＯｐＬ时的明场与荧光。逡逑表２－２不同浓度脂质体时ｓｉＲＮＡ邋Ｓｉｇ－ＩＲ千预后的Ｓｉｇ－ＩＲ邋ｍＲＮＡ扩增结果（叉土Ｓ）逡逑组别逦ｎ逦（Ｘ士Ｓ）逡逑ＮＣ邋７．邋５（ｊ邋Ｌ逦３逦１．０１邋士邋０．邋１４逡逑ＳｉＲＮＡ邋７．５｜ｊ邋Ｌ逦３逦０．３５±０．０５＊＊＊逡逑ＮＣ邋１０｜Ｊ邋Ｌ逦３逦１．邋０７邋士邋０．邋５０逡逑ＳｉＲＮＡ邋１０｜Ｊ邋Ｌ逦３逦０．５６±０．０２逡逑５６逡逑
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 贾世杰;王辉;张新广;张秀彬;徐志强;;自拟益气活血方联合西医治疗缺血性脑卒中恢复期疗效观察[J];现代中西医结合杂志;2016年10期

2 蔡悦;;自拟益气活血方治疗胸痹气虚血瘀证46例[J];中国实用医药;2012年04期

3 李晓星;胡杰林;尤敏;赵瑞珍;韩存恩;谭万初;;解毒益气活血方抑制血管生成的实验研究[J];中医临床研究;2012年08期

4 任钧国;江丽娟;李军梅;李鸿海;刘建勋;;益气活血方对自发性高血压大鼠左心室肥厚的影响[J];微循环学杂志;2011年02期

5 吴雪琴;白玉盛;;益气活血方治疗难治性特发性血小板减少性紫癜的临床观察[J];新疆中医药;2010年02期

6 温兴韬;江正志;温兴禹;;自拟益气活血方治疗急性脑梗死患者51例临床观察[J];安徽医药;2009年10期

7 韩玉晶;冯莹莹;;化痰益气活血方治疗缺血性中风83例临床观察[J];中西医结合心脑血管病杂志;2007年06期

8 王炳胜,刘秀芳,付显成,赵增虎,袁长瑞,胡世金;Clinical Observation on Effect of Yiqi Huoxue Recipe (益气活血方) in Comprehensive Treatment on Advanced Stage of Esophageal Cancer[J];Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine;2000年01期

9 黄书球;;益气活血方治疗十二指肠球部溃疡[J];中西医结合杂志;1988年08期

10 李征;孟琳;秦彦强;肖凌勇;高弼虎;;益气活血方对慢性肾脏病合并高血压患者生活质量影响的临床研究[J];中医药学报;2016年01期

相关会议论文 前10条

1 吴惠珍;陈薇;贺学林;;解毒益气活血方治疗糖尿病肾病的临床观察[A];2016年中国中西医结合学会肾脏疾病专业委员会学术年会论文摘要汇编[C];2016年

2 江宇泳;王宪波;王融冰;;益气活血方抗大鼠肝纤维化的实验研究[A];中华中医药学会第二十二届全国脾胃病学术交流会暨2010年脾胃病诊疗新进展学习班论文汇编[C];2010年

3 葛惠男;恽海峰;;益气活血方治疗消化性溃疡的胃黏膜保护机制研究[A];中华中医药学会脾胃病分会第二十四次全国脾胃病学术交流会论文汇编[C];2012年

4 王大英;金惠根;范华昌;;化痰益气活血方对腹主动脉狭窄模型兔血管病理的影响[A];第八次全国中西医结合心血管病学术会议论文集[C];2007年

5 王宝玉;赵文;牛学敏;杜静华;付娜;赵素贤;王洋;王荣琦;张玉果;南月敏;;益气活血方调节自噬及逆转肝纤维化机制的研究[A];第九届全国疑难及重症肝病大会论文集[C];2017年

6 吴艳春;王灵聪;袁新旺;雷澍;智屹惠;江荣林;;解毒益气活血方改善严重脓毒症患者免疫功能的机制研究[A];第三届全国中西医结合重症医学学术会议论文汇编[C];2013年

7 江毅;程伟;;益气活血方及其拆方对人血管平滑肌细胞增殖影响的观察[A];中华中医药学会心病分会第十次全国中医心病学术年会暨吉林省中医药学会心病第二次学术会议论文精选[C];2008年

8 葛惠男;江国荣;王纯庠;恽海峰;;益气活血方对胃黏膜保护作用的临床与实验观察[A];中华中医药学会脾胃病分会第十九次全国脾胃病学术交流会论文汇编[C];2007年

9 冯其茂;董耀荣;;益气活血方对急性心肌梗塞后左室重构的干预[A];第七次全国中西医结合心血管病学术会议论文汇编[C];2005年

10 葛惠男;龚诚;李江虹;;益气活血方预防NSAIDs相关性胃黏膜损伤的临床研究[A];中华中医药学会第二十二届全国脾胃病学术交流会暨2010年脾胃病诊疗新进展学习班论文汇编[C];2010年

相关重要报纸文章 前1条

1 冯磊;益气活血方可提高肿瘤患者对射线耐受性[N];中国中医药报;2008年

相关博士学位论文 前8条

1 张宇沁;益气活血方对心梗后神经重构及ERK1/2信号通路影响的研究[D];北京中医药大学;2019年

2 张效科;益气活血方对糖尿病大鼠坐骨神经结构和功能影响的实验研究[D];成都中医药大学;2004年

3 程伟;从细胞周期调控探讨益气活血方防治球囊损伤血管狭窄的机理[D];湖北中医学院;2006年

4 田昕;益气活血方对动脉粥样硬化家兔干预作用的实验研究[D];辽宁中医药大学;2007年

5 郑乘龙;益气活血方对心梗大鼠代谢影响及其作用机制研究[D];北京中医药大学;2016年

6 甘大楠;益气活血方治疗乙型肝炎肝硬化腹水气虚血瘀证临床疗效研究[D];北京中医药大学;2014年

7 黄凤;经穴注射BMSCs联合益气活血方对DM后肢缺血大鼠血管再生作用机制研究[D];北京中医药大学;2014年

8 秦培钩;益气活血法干预糖尿病肾病远期疗效及证候变化规律研究[D];中国中医科学院;2015年

相关硕士学位论文 前10条

1 李春红;益气活血方通过Sigma-1受体抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大的研究[D];北京中医药大学;2019年

2 李莉莉;益气活血方治疗气虚血瘀型冠心病稳定型心绞痛的临床疗效观察[D];黑龙江省中医药科学院;2018年

3 丁欢阳;益气活血方治疗老年单纯收缩期高血压（气虚血瘀型）的临床研究[D];甘肃中医药大学;2018年

4 成青莲;益气活血方对冠心病稳定型心绞痛（气虚血瘀证）运动耐量的影响[D];河南中医药大学;2018年

5 董磊鹏;他克莫司及益气活血方治疗PMN的临床观察[D];河南中医药大学;2018年

6 郑芳芳;益气活血方对肺癌放疗患者免疫功能影响[D];承德医学院;2018年

7 王庆;养阴益气活血方对NOD小鼠Tfh相关分子的影响研究[D];浙江大学;2018年

8 李莹;脑梗死气虚血瘀证大鼠模型能量代谢水平及益气活血方干预的研究[D];北京中医药大学;2018年

9 王婕;益气活血方调控Sig-1R、SERCA2a、IP_3R改善心肌能量代谢治疗心衰的研究[D];北京中医药大学;2018年

10 李亮;益气活血方治疗冠心病PCI术后患者临床疗效观察[D];兰州大学;2018年

本文编号：2651381