当归多糖改善炎症性贫血和肾性贫血的作用及机制研究

发布时间：2020-05-07 11:48

【摘要】：当归是治疗贫血的传统中药,当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide,ASP)是从当归饮片中分离纯化得到的水溶性大分子多糖。铁调素(hepcidin)是机体铁代谢平衡的核心调控者,hepcidin高表达在炎症性贫血和肾性贫血的发病过程中发挥着重要作用。促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是调控红细胞生成的必需生长因子,EPO缺乏是引起肾性贫血的主要原因。本课题组在前期研究中发现ASP可以调节缺铁性贫血大鼠铁代谢,降低大鼠血清hepcidin水平,改善贫血。近年来在中药治疗肾性贫血的研究中发现,当归及当归补血汤辅助重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)治疗肾性贫血具有疗效好、安全性高的特点,且能显著减少rhEPO的用量。本文旨在研究ASP抑制hepcidin表达的作用机制,探讨ASP对EPO表达的作用,研究ASP对炎症性贫血和肾性贫血的疗效和作用机制,为开发新型炎症性贫血和肾性贫血的治疗药物提供新思路,也对阐明中药当归治疗贫血的作用机理有积极的作用。本文主要研究内容和成果如下:第一部分当归多糖体外抑制hepcidin表达的研究根据本课题组前期建立的当归多糖分离纯化工艺制备ASP,对其糖含量、纯度、分子量、红外图谱等进行质量考察。结果表明提取的ASP性状均一,产率较高,性质稳定,达到了后续实验的要求。采用重组人IL-6细胞因子刺激HepG2细胞hepcidin表达,分别加入50、100、200?g/mL ASP共培养,通过蛋白质免疫印迹法和免疫荧光分别检测STAT3的磷酸化水平和核转录,采用实时荧光定量PCR检测hepcidin mRNA表达。结果表明,ASP显著抑制了IL-6诱导的STAT3磷酸化和核转录,下调了hepcidin mRNA水平,三个浓度ASP对hepcidin mRNA的抑制率分别为58.8%、66.5%、74.7%,呈剂量依赖性。为进一步探究ASP下调IL-6诱导的STAT3激活和hepcidin表达的作用靶点,加入JAK2蛋白抑制剂AZD1480,研究了ASP在加入AZD1480情况下对IL-6诱导的hepcidin表达的影响。结果发现,在加入AZD1480干预后,ASP对IL-6诱导的p-JAK2及hepcidin mRNA表达无显著影响,表明ASP可能通过抑制JAK2蛋白激活下调JAK2/STAT3信号通路,进而抑制hepcidin转录。采用重组人BMP6细胞因子刺激HepG2细胞hepcidin表达,加入BMP I型受体抑制剂LDN-193189干预,观察了200?g/mL ASP在未加入以及加入LDN-193189情况下对p-SMAD1/5/8和hepcidin mRNA表达的影响。研究表明,ASP能显著抑制BMP6诱导的p-SMAD1/5/8和hepcidin mRNA表达,而在加入LDN-193189干预的细胞中,ASP组p-SMAD1/5/8和hepcidin mRNA的表达相较于BMP6组无显著变化,提示ASP可能通过作用于BMP I型受体来下调BMP/SMAD通路,进而抑制hepcidin转录。给予HepG2细胞脂多糖(lypopolysaccharide,LPS)刺激,分别加入50、100、200μg/mL ASP共培养,考察ASP对LPS刺激的p-STAT3、p-SMAD1/5/8、hepcidin mRNA表达的影响。结果表明,与LPS组相比,三个浓度ASP均显著下调了LPS诱导的p-STAT3和p-SMAD1/5/8;100、200μg/mL ASP组hepcidin mRNA水平相较于LPS组均显著降低,抑制率分别为48%和86.6%,而低浓度ASP组无显著性差异。酶联免疫法(ELISA)检测细胞上清液IL-6水平可知,三个浓度ASP明显抑制了LPS刺激的IL-6分泌,抑制率分别为58.8%、66.5%、74.7%,具有剂量依赖性。蛋白质印迹法检测NF-?B、p-I?B?表达表明,ASP阻断了LPS诱导的I?B?的磷酸化及核NF-?B的表达。根据本部分实验结果可知ASP抑制hepcidin表达的机制为:(1)可能通过抑制JAK2蛋白激活下调JAK2/STAT3信号通路,进而抑制hepcidin转录;(2)可能通过阻断BMP6与BMP I型受体相互作用下调BMP/SMAD信号通路,进而抑制hepcidin转录;(3)通过抑制NF-?B信号通路减少IL-6分泌间接抑制hepcidin表达。本研究为后续ASP作为hepcidin抑制剂治疗铁限制性贫血的体内研究奠定了基础。第二部分当归多糖改善炎症性贫血的体内研究采用给大鼠足跖皮下注射0.15 mL结核分枝杆菌浓度为10 mg/mL的弗氏完全佐剂建立炎症性贫血模型,设立双氯芬酸钠、rhEPO、双氯芬酸钠和rhEPO联合给药三个阳性对照组,分别以0.5 g/kg、1.0 g/kg体重剂量给大鼠灌胃ASP溶液治疗4周。实验结束后检测大鼠血红蛋白(Hb)水平和红细胞(RBC)计数。由结果可知,低、高剂量ASP均显著升高了ACD大鼠Hb水平和RBC计数,低剂量ASP组Hb水平和RBC计数分别升高至135.56 g/L、7.74×10~(12)/L,高剂量ASP组为145.29 g/L、8.5×10~(12)/L。与阳性对照组相比,高剂量ASP对贫血的改善作用与双氯芬酸钠、rhEPO相当,但弱于双氯芬酸钠和rhEPO联合给药。检测大鼠白细胞计数(WBC)和血清TNF-?、IL-6水平可知ASP的治疗明显降低了ACD大鼠WBC计数和血清TNF-?、IL-6水平。此外ASP显著升高了ACD大鼠血清EPO水平。采用普鲁士蓝染色观察大鼠脾脏组织铁沉积,原子吸收光谱法检测脾脏铁和血清铁水平,ELISA检测血清ferritin水平。由结果可知,模型组大鼠脾脏组织显示出明显的铁沉积,脾脏铁含量相较于对照组显著升高了61.4%,血清铁下降了27.2%,表明ACD大鼠组织铁过载,循环铁利用率低;给药ASP治疗后,大鼠脾脏铁沉积得到明显改善,血清ferritin水平降低,血清铁水平升高。检测大鼠血清hepcidin水平和肝脏hepcidin表达可知,给药低、高剂量ASP治疗后血清hepcidin水平分别下降了14.6%和21.3%,肝脏hepcidin表达也显著下调。为探究ASP改善ACD大鼠铁代谢、炎性的具体分子机制,采用蛋白质印迹法检测大鼠相关蛋白表达,包括(1)肝脏调控hepcidin转录的上游JAK2/STAT3信号通路蛋白p-JAK2、p-STAT3、STAT3,BMP/SMAD信号通路蛋白BMP6、p-SMAD1/5/8、SMAD4;(2)脾脏、肝脏铁代谢相关蛋白ferroportin和ferritin;(3)肝脏NF-?B信号通路蛋白IKK?、p-I?B?和NF-?B。结果显示,ASP显著下调了ACD大鼠肝脏JAK2/STAT3和BMP/SMAD通路,升高了脾脏、肝脏ferroportin表达,降低了ferritin水平,抑制了NF-?B信号通路的激活。本部分研究表明ASP主要通过抑制hepcidin表达和抗炎两方面改善炎症性贫血,具体机制分别为:(1)通过下调JAK2/STAT3和BMP/SMAD通路抑制hepcidin表达,进而升高脾脏、肝脏ferroportin表达,增加组织铁输出,从而改善大鼠单核巨噬系统铁沉积,提高循环铁利用率;(2)通过抑制NF-κB的激活下调炎性因子的分泌,一方面间接抑制hepcidin表达,另一方面缓解炎性因子对EPO的抑制作用。本部分研究为ASP作为hepcidin抑制剂防治炎症性贫血提供新的理论和实验依据。第三部分当归多糖体外上调EPO表达的研究本实验采用在培养基中加入50?M CoCl_2刺激Hep3B细胞24小时诱导细胞缺氧,加入100、200?g/mL两种浓度ASP共培养,观察ASP对缺氧诱导HIF-1/2?蛋白和EPO mRNA表达的影响。结果显示,与缺氧组相比,两种浓度ASP均显著上调HIF-1(14)2?蛋白以及EPO mRNA的表达,且呈剂量依赖性。检测HIF-1/2?mRNA表达量可知ASP对HIF-1/2?mRNA水平无显著影响。为探究ASP上调HIF-1(14)2?蛋白表达的作用机制,加入放线菌酮处理Hep3B细胞不同的时间,以抑制蛋白合成检测蛋白的半衰期。结果表明,缺氧诱导的HIF-1(14)2?蛋白半衰期约为0.5 h,而200?g/mL ASP的加入显著延长了蛋白的半衰期大约至3 h。分别采用重组人TNF-?和IL-1?刺激Hep3B细胞,加入100、200?g/mL两种浓度ASP共培养,观察ASP对炎性因子抑制EPO表达的影响。由结果可知,100、200?g/mL ASP的干预显著抑制了TNF-?和IL-1?诱导的GATA2、NF-?B激活,缓解了TNF-?和IL-1?对EPO的抑制作用,上调了EPO mRNA表达,且呈剂量依赖性。接下来观察了ASP对TNF-?在缺氧条件下抑制EPO表达的影响,与对照组相比,缺氧明显上调了核NF-?B和GATA2的表达,TNF-?的加入进一步增加了核NF-?B和GATA2的水平,而200?g/mL ASP组NF-?B和GATA2的表达水平明显减少,且显著性低于缺氧对照组水平。检测EPO mRNA结果显示,ASP显著缓解了TNF-?在缺氧条件下对EPO的抑制作用,且与缺氧对照组相比,ASP组EPO mRNA水平更高。本部分的研究结果表明:(1)ASP通过抑制HIF-2?蛋白降解,延长HIF-2?蛋白的半衰期,进而刺激缺氧诱导EPO的表达,也可能通过抑制缺氧诱导的GATA2、NF-?B激活进一步上调EPO表达;(2)ASP可以显著缓解炎性因子TNF-?、IL-1?对EPO的抑制作用,该作用与下调核核转录因子GATA2、NF-?B有关;(3)ASP能显著缓解TNF-?在缺氧条件下对EPO的抑制作用,一方面通过阻断GATA2、NF-?B激活,一方面可能通过上调HIF-2?蛋白表达促进EPO的转录。该部分研究为后续ASP改善肾性贫血的体内研究奠定了基础。第四部分当归多糖改善肾性贫血的体内研究采用给大鼠先喂食含0.75%腺嘌呤饲料4周再喂食正常饲料4周的方法建立慢性肾脏病(CKD)贫血大鼠模型,以rhEPO为阳性对照药物,给予0.5 g/kg、1.0 g/kg ASP治疗6周。实验期间监测大鼠血常规指标包括Hb、RBC和WBC,及肾功能指标血清尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)。结果表明,CKD大鼠在第4周开始出现贫血,至第6周最为严重,后略有回升,到8周时趋于稳定贫血状态。ASP在给药治疗4周后即第6周时显著上调了Hb水平和RBC计数,随后Hb水平和RBC计数逐渐回升,到第8周时接近正常值,基本纠正了贫血,高剂量ASP作用最显著。由BUN和Scr水平再结合大鼠肾脏组织HE染色结果可知,ASP的治疗在一定程度上改善了CKD大鼠肾功能,缓解了肾组织病变。此外,ASP显著降低了CKD大鼠WBC水平,抑制了CKD大鼠肾脏和脾脏促炎性因子TNF-?、IL-1?和IL-6 mRNA表达,缓解了大鼠炎症反应。铁代谢相关指标的检测结果表明,ASP降低了CKD大鼠脾脏铁和肝脏铁含量;与模型组相比,EPO组、LASP组和HASP组血清铁水平分别升高了21.7%、44.8%和53.1%。实验结束后检测CKD大鼠EPO水平得知,低剂量ASP和高剂量ASP组血清EPO水平相较于模型组分别升高了1.3倍和1.7倍;ASP的治疗显著上调了CKD大鼠肾脏及肝脏EPO mRNA表达,其中低剂量ASP组分别升高了6.5倍、89.2%,高剂量组分别升高了9.1倍、1.3倍。检测大鼠肝脏hepcidin mRNA表达可知,ASP显著抑制了CKD大鼠肝脏hepcidin表达,LASP组和HASP组的抑制率分别为54.1%、76.8%。为探究ASP刺激CKD大鼠内源性EPO分泌的机制,检测大鼠肾脏、肝脏HIF-1?、HIF-2?、GATA2和NF-?B蛋白表达以及脯氨酸羟化酶PHD1、PHD2和PHD3 mRNA表达。由结果可知,ASP激活了CKD大鼠肾脏、肝脏HIF信号通路,抑制了PHD1/2/3mRNA表达,增加了HIF-1/2蛋白积聚;ASP抑制了CKD大鼠肾脏、肝脏GATA2和NF-?B表达。由结果分析可知ASP刺激CKD大鼠内源性肾脏和肝脏EPO分泌的机制如下:(1)通过抑制HIF-2?蛋白降解,增加HIF-2?蛋白水平上调EPO基因转录;(2)通过抑制NF-?B和GATA2激活,缓解NF-?B和GATA2对EPO基因转录的抑制作用增加EPO表达;(3)可能通过改善炎性,缓解炎性对缺氧诱导HIF信号通路抑制作用间接增加EPO表达。提取CKD大鼠骨髓单个核细胞,研究EPO介导的下游细胞内信号转导。结果表明ASP显著增加了骨髓单个核细胞EPOR mRNA的表达;激活了EPOR下游JAK2/STAT5、PI3K/Akt通路,上调了p-JAK2、p-STAT5、p-PI3K和p-Akt表达;增加了信号通路下游抗凋亡基因Bcl-xL mRNA水平和Bcl-2/Bax比例以及铁代谢相关基因TfR1、ERFE mRNA的表达。以上结果表明ASP的治疗上调了CKD大鼠骨髓单个核细胞EPOR表达,从而增强了骨髓红系细胞对EPO的响应;激活了EPOR下游细胞内JAK2/STAT5、PI3K/Akt信号通路,上调了抗凋亡和铁代谢相关目的基因的表达,从而抑制了红系细胞凋亡,促进其增殖分化,增加了红系细胞对铁的利用,促进血红蛋白的合成。研究ASP改善CKD大鼠铁代谢的机制结果可知,ASP下调了p-STAT3、p-SMAD1/5/8表达;增加了肝脏、脾脏ferroportin蛋白水平;减少了肝脏、脾脏ferritin蛋白水平;抑制了脾脏DMT1和TfR1 mRNA表达。由结果分析可知ASP改善CKD大鼠组织铁沉积,升高循环铁水平的分子机制总结如下:(1)ASP通过下调STAT3和SMAD信号通路抑制了CKD大鼠肝脏hepcidin表达,进而上调了大鼠脾脏和肝脏ferroportin的水平,最终增加了大鼠脾脏铁和肝脏铁的输出;(2)ASP可能通过改善炎性抑制了CKD大鼠ferritin表达,从而减少了大鼠肝脏、脾脏铁的储存;(3)ASP可能通过改善炎性减少了CKD大鼠DMT1和TfR1 mRNA水平,从而减少了巨噬细胞对铁的摄入。本部分研究表明ASP通过刺激内源性肾脏、肝脏EPO产生升高了血清EPO水平,增加了骨髓单个核细胞EPOR mRNA表达,进而激活了EPOR下游细胞内信号转导,促进了红细胞生成;通过抑制hepcidin表达和改善炎性动员了组织铁的利用,升高了血清铁水平,增加了红细胞生成所需要的铁原料的供应,最终纠正了肾性贫血。本文为开发新型肾性贫血的治疗药物提供新思路,也揭示了中药当归辅助治疗肾性贫血的机理。
【图文】：

机体,铁代谢,缺铁性贫血

图 1-1 Hepcidin 对机体铁平衡的调控[39]ig.1-1 Hepcidin has a central role in maintenance of iron homeosta为传统治疗贫血的中草药，其在调节铁代谢，抑制 hepcidin 方。本课题组从当归饮片中提取分离纯化得到大分子化合物 AS ASP 能改善缺铁性贫血大鼠铁代谢，降低缺铁性贫血大鼠血深入探讨 ASP 对 hepcidin 表达的抑制作用及机制，将对 ASP病及阐明中药当归治疗贫血的作用机理有积极的作用。主要研究ASP对炎症因子依赖JAK2/STAT3通路介导的hepci铁水平依赖 BMP/SMAD 通路介导的 hepcidin 表达的作用。根工艺，采用热水提、乙醇沉淀的方法分离当归粗多糖，再经反及葡聚糖凝胶色谱柱分级纯化得到 ASP。采用人肝癌 HepG26细胞因子刺激HepG2细胞hepcidin表达，，研究ASP对IL-6诱导

流程图,当归多糖,流程图,糖含量测定

23图 1-2 当归多糖提取（A）、纯化（B）流程图Fig.1-2 Scheme of the extraction and purification ofASP糖糖含量测定酚-硫酸法对当归多糖的糖含量进行测定[45]。谱扫描0 mg 当归多糖样品，溶解于 0.1 M NaOH 溶液配制成 1 mg/mL 范围内进行紫外扫描。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】