基于SIRT3研究淫羊藿苷对鱼藤酮诱导的多巴胺能神经元损伤的作用机制

发布时间：2020-05-07 12:45

【摘要】：目的:研究淫羊藿苷(Icariin,ICA)对鱼藤酮(Rotenone,ROT)诱导的多巴胺能神经元细胞损伤的保护作用,探讨可能的分子机制。方法:研究分为两个部分,即动物实验和PC12细胞模型实验两个部分。1、动物实验:75只SD雄性大鼠,220-250 g,分为空白组、ICA(30 mg/kg)组、ROT(1 mg/kg)组、ROT+ICA(15 mg/kg)组、ROT+ICA(30 mg/kg)组,连续5周颈背部皮下注射ROT(1 mg/kg/day),灌胃ICA(15 mg/kg/day或30 mg/kg/day),空白组灌胃相同体积的ddH_2O和皮下注射溶媒。转棒实验评估大鼠行为学功能;组织TH染色检测大鼠中脑黑质多巴胺神经元数量;Western blot检测大鼠纹状体组织中SIRT3和PGC-1α蛋白表达。2、PC12细胞实验:PC12细胞分为空白组、ICA(4μM)组、ROT(0.5μM)组、ROT+ICA(2μM)组、ROT+ICA(4μM)组。(1)ICA对ROT的保护作用。细胞预先给予ICA干预2 h后加入ROT继续处理24 h。MTT法检测细胞活力;Oxygraph-2k线粒体呼吸功能仪检测细胞线粒体呼吸功能;流式细胞仪检测细胞ROS含量;SOD试剂盒检测细胞内SOD活性;Western blot检测细胞SIRT3和PGC-1α蛋白表达。(2)PGC-1αsiRNA沉默对ICA保护作用的影响。PGC-1αsiRNA转染PC12细胞24 h后,提前2 h给与ICA,加入ROT继续处理24 h。MTT法检测细胞活力;Western blot检测细胞PGC-1α和SIRT3蛋白表达水平。(3)SIRT3抑制剂3-TYP干预对ICA保护作用的影响。细胞提前2 h孵育3-TYP和ICA,加入ROT继续处理24 h。MTT法检测细胞活力;Oxygraph-2k线粒体呼吸功能仪检测细胞线粒体呼吸功能;流式细胞仪检测细胞ROS含量;SOD试剂盒检测细胞内SOD活性;Western blot检测细胞SIRT3和PGC-1α蛋白表达。结果:1、动物实验:(1)通过转棒实验检测动物行为学,结果显示ROT组大鼠转棒时间较空白组明显减少;而给予ICA干预后,大鼠转棒时间增加。(2)组织TH染色结果显示:ROT组多巴胺神经元数量明显减少;而ICA干预明显缓解ROT所诱导的多巴胺神经元数量减少。(3)Western blot检测纹状体组织中SIRT3和PGC-1α蛋白表达水平,结果显示:与空白组比,ROT组大鼠纹状体组织中SIRT3和PGC-1α蛋白表达降低;给予ICA干预后,SIRT3和PGC-1α蛋白表达升高。2、PC12细胞模型实验:(1)ICA对ROT的保护作用。ROT处理细胞24 h后,细胞活力、线粒体呼吸功能、SOD活性以及SIRT3和PGC-1α蛋白表达较空白组均降低,而ICA干预后,细胞活力、线粒体呼吸功能、SOD活性以及SIRT3和PGC-1α蛋白表达均上升。流式细胞仪检测细胞内ROS含量,结果显示:ROT组细胞内ROS含量较空白组升高;而ICA干预后,细胞内ROS含量降低。(2)PGC-1αsiRNA沉默对ICA保护作用的影响。PGC-1αsiRNA转染细胞后,MTT检测结果显示,ICA对ROT诱导的细胞毒性表现出保护作用,而这一作用在siRNA转染细胞后消失。同时Western blot检测PGC-1α和SIRT3蛋白表达,发现PGC-1α的沉默并不影响SIRT3蛋白表达。(3)SIRT3抑制剂3-TYP干预对ICA保护作用的影响。MTT结果显示,ICA对ROT诱导的细胞毒性表现出保护作用,而这一作用在共同孵育3-TYP后明显消失。Western blot结果显示:3-TYP干预会导致SIRT3蛋白表达降低,同时引起PGC-1α蛋白表达下降。进一步实验发现,3-TYP会抑制细胞线粒体呼吸功能、增加细胞内ROS含量、导致细胞内SOD活性的降低;同时3-TYP削弱ICA对细胞线粒体呼吸功能、ROS水平以及SOD活性的影响。结论:ICA对ROT诱导的多巴胺能神经元细胞损伤具有保护作用,其保护机制可能与上调SIRT3、改善线粒体功能和氧化应激有关。
【图文】：

图 1 ICA 对 ROT 诱导的大鼠运动功能的影响ig.1 Effect of ICAon motor function of rats induced by Rn = 8, *p < 0.05 vs control group;#p < 0.05 vs ROT group.护 ROT 诱导的多巴胺能神经元损伤元的的丢失是 PD 模型重要病理特征之一。大鼠经H 染色检测中脑黑质组织中 DA 神经元数量，结果经元数量较正常组、正常给药组减少大约 52%（ DA 神经元数量显著升高（图 2）。

图 2 ICA 对 ROT 诱导的中脑黑质多巴胺能神经元数量的影响Fig.2 Effect of ICA on ROT-induced DA neuronal loss in the rat substantia nigra.n = 5, **p < 0.01 vs control group;#p < 0.05 vs ROT group.2.3 ICA 对纹状体中 SIRT3 和 PGC-1α蛋白表达的影响大鼠给药 5 周后，取纹状体组织，Western blot 法检测大鼠纹状体组织中SIRT3 和 PGC-1α蛋白表达。结果显示:与空白组比较，ROT 处理导致纹状体中SIRT3 和 PGC-1α蛋白表达降低（p < 0.05）；而与 ROT 单独处理组相比，给予ICA 干预后，纹状体中 SIRT3 和 PGC-1α蛋白表达明显增高（图 3）。
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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本文编号：2652992