通络醒脑泡腾片活性成分P-15通过自噬-溶酶体途径抗AD的机制研究

发布时间：2020-05-07 13:15

【摘要】：第一部分基于AD细胞模型的通络醒脑泡腾片活性成分筛选研究目的:采用H_2O_2和Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞损伤构建拟AD细胞模型,筛选确定通络醒脑泡腾片中具有神经细胞保护作用的活性成分,为后续研究奠定基础。方法:选用SH-SY5Y细胞为研究对象,参考文献给予50、100、150、200、400、500、600、800uM的H_2O_2损伤细胞2h、8h、12h和24h,采用MTT法测定H_2O_2对细胞活性的影响,确定H_2O_2诱导细胞损伤的最佳浓度和时间;给予5uM、10uM、30uM、60uM、100uM寡聚体Aβ_(25-35)损伤细胞24h和48h后,采用MTT法测定Aβ_(25-35)对细胞活性的影响,确定Aβ_(25-35)诱导细胞损伤的最佳浓度和时间;给予通络醒脑泡腾片成分及其它来源的活性成分(12.5、25、50uM)预处理细胞24h,以500uM H_2O_2(IC_(50))作用细胞2h或20uM Aβ_(25-35)(IC_(50))作用细胞24h后,采用MTT法测定细胞活性,并经过多次盲法重复筛选验证,确定通络醒脑泡腾片中对H_2O_2或Aβ_(25-35)损伤细胞模型具有保护作用的活性成分,用于后续研究。结果:采用H_2O_2损伤SH-SY5Y细胞,H_2O_2呈剂量依赖性降低细胞活性,H_2O_2作用细胞2h的IC_(50)为500uM;经3次盲法筛选发现,GHX-13、P-15、GHC-6对H_2O_2损伤细胞模型的保护作用明确且稳定性较好;采用寡聚体Aβ_(25-35)损伤SH-SY5Y细胞,Aβ_(25-35)呈时间和剂量依赖性降低细胞活性,Aβ_(25-35)作用细胞24h的IC_(50)为20uM。经过3次盲法重复筛选发现,P-15、GHC-6对Aβ_(25-35)损伤细胞模型的保护作用明确且稳定性较好。通过对比化合物来源和揭盲发现,其中P-15来源于通络醒脑泡腾片成分,因此确定P-15为通络醒脑泡腾片活性成分,用于后续研究。结论:通过多次盲法重复筛选发现,源于通络醒脑泡腾片的活性成分P-15对H_2O_2和Aβ_(25-35)损伤的SH-SY5Y细胞保护作用明确,且重现性高和稳定性好,故后续研究将以P-15为研究对象进行。第二部分P-15对Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y拟AD细胞模型自噬-溶酶体途径的调控作用及机制研究目的:基于Aβ_(25-35)诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型再次验证P-15的神经保护作用,并考察P-15对该细胞模型自噬-溶酶体途径的调控作用和对mTOR/TFEB通路的影响,揭示P-15通过自噬-溶酶体途径调控抗AD的分子机制。方法:1.自噬流阻滞参与Aβ_(25-35)介导的自噬泡的异常堆积的研究1.1 Aβ_(25-35)诱导的SH-SY5Y细胞损伤的自噬泡水平的时间变化规律研究以20uM Aβ_(25-35)作用SH-SY5Y细胞0 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48h,MDC染色法检测自噬泡水平,Western Blot法检测LC3-II/I比值和P62/SQSTM1蛋白水平的表达水平。1.2 Aβ_(25-35)诱导的自噬泡异常堆积与自噬的过度激活的相关性研究以6.25~100uM预处理细胞细胞2h后,各组细胞给予20uM Aβ_(25-35)或培养基作用细胞24h,采用MTT法测定细胞活性,确定CQ的最大无毒浓度和CQ对Aβ_(25-35)诱导的细胞活性下降的影响。将细胞设置为4组:(1)正常组(不作任何处理),(2)CQ组(25uM CQ预处理2h),(3)Aβ_(25-35)组(20uM),(3)Aβ_(25-35)+CQ组(25uM CQ预处理2h),Aβ_(25-35)作用24h后,Western Blot法检测LC3-II/I比值。2.P-15对Aβ_(25-35)诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护及对自噬-溶酶体途径的调控作用2.1 P-15对Aβ_(25-35)诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用研究以3.125~400uM P-15分别处理细胞24h和48h,采用MTT法测定细胞活性,确定P-15的最大无毒浓度。将细胞设置为(1)正常组(不作处理),(2)Aβ_(25-35)(20uM Aβ_(25-35)),(3)P-15组(20uM Aβ_(25-35)+3.125~50uM P-15),(4)调零孔(不接种细胞),P-15预处理细胞24h和48h后,给予20uM Aβ_(25-35)损伤24h,采用MTT法检测P-15对细胞活性的影响,确定P-15对Aβ_(25-35)诱导的细胞损伤的保护作用的最佳时间和浓度范围;采用倒置显微镜观察细胞形态,观察P-15对Aβ_(25-35)诱导的细胞损伤的细胞形态的影响。2.2 P-15对Aβ_(25-35)诱导的自噬泡聚集的影响将细胞设置为(1)正常组(不作处理),(2)Aβ_(25-35)(20uM Aβ_(25-35)),(3)P-15组(20uM Aβ_(25-35)+6.25~50uM P-15),各组细胞处理3,6,12,24,48h后,检测MDC的平均荧光强度。2.3 P-15对Aβ_(25-35)诱导的SH-SY5Y细胞损伤的溶酶体功能的影响将细胞设置为(1)正常组(不作处理),(2)Aβ_(25-35)(20uM Aβ_(25-35)),(3)P-15组(20uM Aβ_(25-35)+6.25~50uM P-15),P-15预处理细胞24h后,给予20uM Aβ_(25-35)损伤24h,Western Blot法检测Cathepsin D的蛋白水平;设置(1)空白对照组(不作任何处理),(2)EBSS对照组(EBSS,处理30min),(3)CQ对照组(25uM CQ,处理2h),(4)Aβ_(25-35)(20uM Aβ_(25-35)),(5)P-15组(50uM P-15+20uM Aβ_(25-35)),P-15预处理细胞24h后,给予20uM Aβ_(25-35)损伤24h,Lyso-Tracker荧光探针法检测溶酶体数目及Lyso-Tracker平均荧光强度;2.4 P-15对Aβ_(25-35)诱导的SH-SY5Y细胞损伤的自噬流的影响将细胞设置为(1)正常组(不作处理),(2)Aβ_(25-35)(20uM Aβ_(25-35)),(3)P-15组(20uM Aβ_(25-35)+6.25~50uM P-15),P-15预处理细胞24h后,给予20uM Aβ_(25-35)损伤24h,Western Blot法检测LC3-II/I比值和P62/SQSTM1的蛋白水平;以mCherry-GFP-LC3腺病毒(MOI=2)转染SH-SY5Y细胞,将转染成功后的细胞分为(1)正常组(不作任何处理),(2)模型组(20uM Aβ_(25-35)),(3)P-15组(50uM P-15+20uM Aβ_(25-35)),P-15预处理细胞24h后,给予20uM Aβ_(25-35)损伤24h,激光共聚焦显微镜下观察P-15对自噬流的影响。3.CQ对P-15提高Aβ_(25-35)诱导下降的细胞活性的作用的影响将细胞设置为(1)正常组(不作任何处理),(2)CQ组(25uM CQ预处理2h),(3)Aβ_(25-35)组,(4)P-15+Aβ_(25-35)组,(5)P-15+Aβ_(25-35)组+CQ组(25uM CQ预处理2h),P-15预处理细胞24h后,给予20uM Aβ_(25-35)损伤24h,采用MTT法测定细胞活性。4.P-15对Aβ_(25-35)诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型的mTOR/TFEB通路的影响。将细胞设置为(1)正常组(不作处理),(2)Aβ_(25-35)(20uM Aβ_(25-35)),(3)P-15组(20uM Aβ_(25-35)+6.25~50uM P-15),P-15预处理细胞24h后,给予20uM Aβ_(25-35)损伤24h,Western Blot法检测TFEB总蛋白水平、TFEB核蛋白水平及p-mTOR/mTOR的比值。实验结果:1.自噬流阻滞参与Aβ_(25-35)介导的自噬泡的异常堆积的研究1.1 Aβ_(25-35)诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型的自噬泡的时间变化规律研究20uM Aβ_(25-35)呈时间依赖性增强细胞中的MDC平均荧光强度(p0.05或p0.01),增加LC3-II/I比值(p0.05或0.01)和P62/SQSTM1的蛋白水平(p0.05或p0.01),提示Aβ_(25-35)呈时间依耐性介导细胞胞质内自噬泡聚集和自噬流阻滞。1.2 Aβ_(25-35)诱导的自噬泡异常堆积是否与自噬的过度激活的相关性研究6.25~25uM CQ对正常组的细胞活性没有明显影响(p0.05),而在该剂量范围内CQ呈剂量依赖性协同Aβ_(25-35)诱导细胞活性下降(p0.05或p0.01)。与正常组比较,25uM CQ预处理细胞2h或Aβ_(25-35)作用细胞24h,可显著上调LC3-II/I比值(p0.01);与Aβ_(25-35)组比较,Aβ_(25-35)+CQ组的LC3-II/I比值没有明显差异(p0.05),提示Aβ_(25-35)介导的自噬体异常聚集与自噬过度激活无关。2.P-15对Aβ_(25-35)诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护及对自噬-溶酶体途径的调控作用2.1 P-15对Aβ_(25-35)诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用P-15的给药浓度在3.125~50uM区间内作用细胞24h和48h,对SH-SY5Y细胞活性无影响(p0.05),当给药浓度达100~400uM时,细胞活性明显下降(p0.01);P-15给药浓度在6.25~50uM区间内,对Aβ_(25-35)诱导的细胞活性损伤有显著的保护作用(p0.05或p0.01),能显著拮抗细胞胞体皱缩、细胞膜破裂、细胞间隙变大、胞质内颗粒物沉积和空泡样结构增多等细胞形态改变。2.2 P-15对Aβ_(25-35)诱导的自噬泡聚集的影响与空白组比较,Aβ_(25-35)呈时间依赖性增加MDC的平均荧光强度(p0.05或p0.01);与Aβ_(25-35)组比较,P-15作用12h和24h能明显下调MDC平均荧光强度(p0.05或p0.01),提示P-15能显著缓解Aβ_(25-35)介导的自噬体异常聚集。2.3 P-15对Aβ_(25-35)诱导的SH-SY5Y细胞损伤的溶酶体功能的影响与空白组比较,Aβ_(25-35)组的平均荧光强度和Cathepsin D蛋白水平降低(p0.05或p0.01);与Aβ_(25-35)组比较,P-15可以明显恢复Aβ_(25-35)诱导下降的LysoTracker的平均荧光强度(p0.05),明显上调Cathepsin D蛋白水平(p0.05或p0.01);提示P-15对溶酶体功能具有上调作用。2.4 P-15对Aβ_(25-35)诱导的SH-SY5Y细胞损伤的自噬流的影响与空白组比较,Aβ_(25-35)组的LC3-II/I比值和P62/SQSTM1蛋白表达水平显著升高(p0.01)。与Aβ_(25-35)组比较,P-15能明显降低LC3-II/I比值和P62/SQSTM1蛋白表达水平(p0.05或p0.01);以mCherry-GFP-LC3腺病毒成功转染SH-SY5Y细胞,与Aβ_(25-35)组比较,P-15可明显降低黄色斑点数目,增加红色斑点数,提示P-15可促进自噬流。3.CQ对P-15提高Aβ_(25-35)诱导下降的细胞活性的作用的影响与空白组比较,Aβ_(25-35)能显著诱导细胞活性下降(p0.01);与P-15+Aβ_(25-35)组比较,CQ预处理2h阻断溶酶体后,P-15提高细胞活性的作用减弱(p0.05),提示P-15提高Aβ_(25-35)诱导下降的细胞活性与上调溶酶体功能相关。4.P-15对Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞损伤模型的mTOR/TFEB通路的影响。与空白组比较,Aβ_(25-35)对总细胞中TFEB水平没有显著影响(p0.05),但能显著减少细胞核的TFEB蛋白水平(p0.05或p0.01),增加p-mTOR/mTOR比值(p0.01);与Aβ_(25-35)组细胞比较,P-15对总细胞中TFEB水平没有显著影响(p0.05),但能显著增加细胞核的TFEB蛋白水平(p0.05或p0.01),降低p-mTOR/mTOR比值(p0.05或p0.01)。结论:20uM Aβ_(25-35)作用SH-SY5Y细胞可呈时间依耐性诱导细胞胞质内自噬泡的异常聚集。Aβ_(25-35)介导的细胞胞质内自噬泡的异常堆积,与自噬体过度形成无关,与自噬流阻滞相关。P-15对Aβ_(25-35)诱导的细胞损伤有明显的保护作用,其有效浓度为6.25~50uM,其通过抑制mTOR/TFEB信号通路恢复溶酶体功能,促进自噬流以介导自噬泡的清除,发挥对Aβ_(25-35)诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。第三部分P-15对APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力的影响及调控自噬-溶酶体途的验证研究目的:考察P-15对APP/PS1转基因小鼠学习记忆功能、海马CA1区病理形态、海马组织超微病理结构及神经元内Aβ沉积的影响,并考察其通过mTOR/TFEB途径促进自噬-溶酶体途径产生神经保护作用的机制,验证细胞实验的结论。方法:将3月龄雄性APP/PS 1转基因小鼠10只随机均分为APP/PS1组和P-15组,另取同性别同月龄的C57小鼠5只作为正常对照组,P-15组灌胃给予P-15(40 mg/kg),正常对照组、APP/PS 1组灌胃给予等体积生理盐水(NS),每日一次,连续6个月,采用避暗法和Morris水迷宫法检测小鼠学习记忆能力。HE染色检测小鼠的海马CA1区的病理形态学;电镜法观察海马的超微结构;免疫组化法测定海马区的神经元内Aβ沉积;Western blot法测定LC3-II/I比值和P62/SQSTM1的蛋白水平、Cathepsin D蛋白水平、总细胞和细胞核中的TFEB蛋白水平及p-mTOR/mTOR比值。结果:与正常对照组小鼠比较,APP/PS1小鼠在避暗实验中的逃避潜伏期延长(p0.05),错误次数增加,无显著性差异(p0.05);Morris水迷宫的逃避潜伏期明显延长(p0.05),目的象限游泳时间的百分比明显下降(p0.05),穿越平台次数减少,无显著性差异(p0.05);海马CA1区的椎体细胞排列稀疏,胞核深染固缩;细胞质内细胞器溶解,突触后膜显著扩张,髓神经纤维轴索呈脱髓鞘特征,神经元内Aβ沉积面积增加;海马组织中的LC3-II/I和P62/SQSTM1的蛋白表达水平均增加(p0.01或p0.05),Cathepsin D的表达降低(p0.05);脑组织中总TFEB水平没有显著影响(p0.05),但细胞核的TFEB蛋白表达水平显著降低(p0.05),脑组织p-mTOR/mTOR比值显著增加(p0.05)。与APP/PS1组小鼠比较,P-15组的避暗潜伏期明显延长(p0.01),错误次数降低,无显著性差异(p0.05);Morris水迷宫的逃避潜伏期明显缩短(p0.01),目的象限游泳时间百分比明显增加(p0.05),穿越平台次数增加,无显著性差异(p0.05);海马CA1区的病变程度和海马组织超微结构损伤减轻,神经元内Aβ沉积减少;脑组织中的LC3-II/I比值显著性降低(p0.01),P62/SQSTM1的蛋白表达水平均降低,无统计学差异(p0.05),Cathepsin D的表达水平增加(p0.05);脑组织总蛋白中TFEB表达水平无明显改变(p0.05),但细胞核的TFEB蛋白水平显著增加(p0.05),脑组织p-mTOR/mTOR比值显著降低(p0.05)。结论:P-15能改善APP/PS1转基因小鼠的学习记忆功能,改善海马CA1的病理形态学和海马组织的超微结构损伤,减少神经元内Aβ沉积,并能通过抑制mTOR的磷酸化,提高TFEB的核转录水平,恢复溶酶体功能,促进自噬-溶酶体途径发挥抗AD的作用,与细胞实验结论一致。
【图文】：

成都中医药大学 2018 届硕士毕业生论文酸化 TFEB 将其隔离于细胞核外。饥饿或应激条件下，mTORC1 去磷酸化，TFEB磷酸化水平下降，14-3-3 蛋白和 TFEB 结合减少，TFEB 转录入核。自噬诱导剂Rapamincy 抑制 mTORC1 磷酸化后，去磷酸化的 TFEB 入核调控溶酶体活性的作用增强[60-61]。TFEB 沉默后，，饥饿可诱导 mTORC1 去磷酸化，但其上调溶酶体活性的作用消失[62 ]，提示 TFEB 的转录核与 mTORC1 磷酸化抑制呈依赖性关系。因此，mTOR/TFEB 通路对调控溶酶体功能具有重要作用。mTOR/TFEB 调控自噬-溶酶体途径见图 1。

本实验技术路线图
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285

【参考文献】

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本文编号：2653030