三七和黄连提取物肠道菌群代谢及药代动力学初步研究

发布时间：2020-05-07 13:21

【摘要】：目的:本文以三七和黄连提取物为载体,以三七中的人参皂苷Rg_1、人参皂苷Rb_1和黄连中的小檗碱、黄连碱为研究对象,分别从体外肠道菌群代谢和大鼠体内药代动力学两个方面进行研究,阐明三七和黄连提取物与肠道菌群的相互作用关系。方法:1.运用高效液相色谱-紫外检测器法(HPLC-UV)建立三七中皂苷类成分和黄连中生物碱类成分在肠菌液中的分析方法;2.采用离体粪便温孵法,分别将三七提取物、黄连提取物以单用和联用的方式与健康人类,正常大鼠和伪无菌大鼠的粪菌液在体外37℃厌氧环境下共同培养,分析比较各组分在24 h之内经肠道菌群代谢作用的含量变化及趋势;3.运用超高效液相-串联质谱法(UPLC-MS/MS)建立血浆样品中4个组分的含量测定方法;4.用混合抗生素建立伪无菌大鼠模型,将三七和黄连提取物以单用和联用的方式分别灌胃给予正常大鼠和伪无菌大鼠,比较在两种大鼠体内的药代动力学研究。结果:1.用HPLC-UV建立皂苷类成分和生物碱类的成分在粪菌液中的分析方法,其专属性、线性关系、精密度、稳定性和回收率均良好。2.人参皂苷Rg_1在健康人和正常大鼠的粪菌液代谢中,三七组和三七+黄连组均表现为4 h内很稳定,之后含量逐渐下降,24 h后仍能被检测到,与三七组相比,三七+黄连组含量下降趋势明显减缓;在伪无菌大鼠的粪便孵育液中的三七组和三七+黄连组含量下降趋势无显著性差异;与正常大鼠的粪菌液中三七组比较,人的粪菌液中三七组含量下降较快;与正常大鼠的粪菌液中三七组比较,伪无菌大鼠菌液中三七组含量下降趋势减缓。3.人参皂苷Rb_1在健康人和正常大鼠的粪菌液代谢中,三七组含量在24 h内随着时间逐渐下降接近为零,在2 h内均迅速降低,但三七+黄连组含量下降趋势减缓,尤其在2 h内含量下降明显减慢;在伪无菌大鼠的粪便孵育液中的三七组和三七+黄连组均没有完全代谢,24 h后含量下降至50%左右,且两组之间的下降趋势无明显差异。4.小檗碱和黄连碱在人、正常大鼠、伪无菌大鼠的粪菌液中黄连组和三七+黄连组的含量下降均不明显。5.用UPLC-MS/MS建立皂苷类成分和生物碱类的成分在血浆样品中的分析方法,其专属性、线性关系、精密度、稳定性和回收率均良好。6.正常大鼠体内药动学结果显示,与三七组比较,三七+黄连组的人参皂苷Rg_1、人参皂苷Rb_1在体内血药浓度较高,达峰时间T_(max)均提前,吸收程度增加,半衰期T_(1/2)、达峰浓度C_(max)和药时曲线下面积AUC_((0-∞))均增加,且具有统计学差异(P0.05);与黄连组比较,三七+黄连组的小檗碱和黄连碱T_(max)略提前,吸收速率略快,C_(max)、AUC_((0-∞))略增加,但均无显著性差异。7.伪无菌大鼠体内药动学结果显示,其黄连组和三七+黄连组之间无显著性差异;与正常大鼠三七组比较,伪无菌三七组的人参皂苷Rg_1、人参皂苷Rb_1的达峰时间T_(max)减少,半衰期T_(1/2)、达峰浓度C_(max)和药时曲线下面积AUC_((0-∞))均增加,且具有统计学差异(P0.05);与正常大鼠黄连组比较,伪无菌黄连组的小檗碱和黄连碱达峰时间T_(max)增加、半衰期T_(1/2)、达峰浓度C_(max)和药时曲线下面积AUC_((0-∞))均减少,且具有统计学差异(P0.05)。结论:1.肠道菌群对三七皂苷类成分代谢作用明显,对黄连生物碱代谢不明显。2.三七在人,正常大鼠的肠道菌群代谢中具有差异性,其中人的肠道菌群代谢皂苷类成分能力最强。3.三七与黄连联用可有效抑制三七皂苷类成分的代谢作用,但对黄连生物碱类成分无明显作用。4.三七与黄连联用在大鼠体内可促进三七皂苷类成分的吸收并提高其生物利用度,但对黄连生物碱成分无明显作用。5.抑制肠道菌群可有效提高三七皂苷类的吸收和生物利用度,但降低黄连生物碱类的吸收和生物利用度,使得在伪无菌大鼠体内单用和联用无显著性差异。6.三七与黄连联用的化学效应机制与β-葡萄糖苷酶有关。运用HPLC-UV和UPLC-MS/MS技术建立分析方法,分别应用于肠菌液中及血浆样品中测定三七和黄连提取物主要成分的含量,该方法准确可靠,便于操作。初步研究在三七和黄连提取物单用与联用时,基于肠道菌群的体外代谢研究,揭示四种有效成分在体外肠道菌群中的代谢规律以及二者联用可有效抑制肠道菌群对三七皂苷类成分的代谢作用;大鼠体内药代动力学研究揭示了三七与黄连联用可显著提高三七皂苷类成分的生物利用度,并与肠道菌群中的糖苷酶的活性密切相关,为中药复方田黄片的临床用药提供依据,也为进一步研制高效制剂、提高中药生物利用度提供理论参考。
【图文】：

HPLC色谱,专属性,空白,人参皂苷

分别从人、正常大鼠、伪无菌大鼠取适量新鲜粪便与无菌生理盐水按比例 l:5(g/m混合，玻璃棒搅匀，经过三层纱布过滤所得滤液即为相应的肠道菌液。取适量肠道菌群与厌氧培养基按 l:9(v/v)的比例混合，摇匀后即得到相应的肠菌孵育液[71]。将肠菌孵育液分成两份，一份用于离体代谢试验，另一份需在在 0.07 MPa、115℃条件下灭菌20 min，得到空白肠菌孵育液用作方法学的验证。2.2.1.5 生物样品的前处理向 300 μL 的肠菌液和药液共同孵育体系中加入 1.5 mL 的水饱和正丁醇：乙酸乙酯（3：1）的萃取液，涡旋 3 min，再以 4℃，12000 rpm/min 离心 10 min。取上清 1mL 挥干，用初始流动相 240 μL 复溶，涡旋 3 min，再以 4℃，15000 rpm/min 离心，取上清液上样，，供 HPLC 分析。2.2.1.6 方法学验证(1) 方法的专属性考察按“2.2.1.1”项下，记录空白肠菌孵育液、空白肠菌孵育液+人参皂苷 Rg1+人参皂苷 Rb1和空白肠菌液+三七提取物的色谱图，结果见图 2-1 显示：两个组分可完全分离，且空白肠菌孵育液中的其他组分不产生干扰，说明方法专属性较好。

黄连碱,小檗碱,空白,专属性

图 2-2 考察专属性注：空白肠菌孵育液（a）、空白肠菌孵育液+小檗碱+黄连碱混合对照品（b）空白肠菌孵育液黄连提取物（c）的 HPLC 色谱图，1 黄连碱；2 小檗碱按“2.2.2.1”项下，记录空白肠菌孵育液、空白肠菌孵育液+小檗碱+黄连碱以及空白肠菌孵育液+黄连提取物的色谱图，结果见图 2-2 显示：两个组分可完全分离，且空白肠菌孵育液中的其他组分不产生干扰，说明方法专属性较好。(2) 标准曲线的考察表 2-13 小檗碱、黄连碱在各菌液中的标准曲线成分人菌液正常大鼠菌液伪无菌大鼠菌液小檗碱 y = 8797.9x 3950.8R2 = 0.9992y = 12496x 33850.5R2 = 0.9999y =9846x 5350.5R2 = 0.9997黄连碱 y = 22326x - 3656.2R2 = 0.9999y = 17665x - 571206R2 = 0.9999y = 23934x 8481.8R2 = 0.9999
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】