【摘要】：目的:研究化痰活血解毒方对LPS诱导的RASMC分泌炎症因子、增殖、迁移、凋亡、表型转化的影响及其机制是否受MAPKs信号通路的调节。方法:1.含药血清的制备:选取16只2.5±0.53彽腟D日本大耳白兔,随机分为四组:瑞舒伐他汀组(RS,2.5mg/kg/d)、化痰活血解毒方低剂量组(ZD,17.2mg/kg/d)、化痰活血解毒方高剂量组(ZG,34.4mg/kg/d)和空白组(Control,同等体积的生理盐水),连续灌胃7天,末次给药3小时腹主动脉取血、取上清,过滤、灭活,-80℃冰箱储存备用。2.实验分组:本实验共分为5组:空白组、LPS组、LPS+瑞舒伐他汀组、LPS+化痰活血解毒方低剂量组、LPS+化痰活血解毒方高剂量组。3.MTT法检测LPS对RASMC增殖的影响。4.MTT法检测化痰活血解毒方对LPS诱导的RASMC增殖的干预作用。5.ELISA法检测化痰活血解毒方对LPS诱导的RASMC分泌炎症因子及TIMP-1表达的作用。6.流式细胞仪检测化痰活血解毒方对RASMC凋亡的影响。7.Transwell小室检测化痰活血解毒方对LPS诱导的RASMC迁移的作用。8.RT-PCR和Weston blotting检测RASMC中MAPKs信号通路相关基因和蛋白(p38MAPK、ERK、JNK)、主要表型标志基因和蛋白(α-SM-actin、OPN)及相关凋亡基因和蛋白(caspase-3,Bax,Bcl-2)的表达水平。结果:1.LPS对RASMC生长及增殖的影响:0.01、0.1、0.5、1、5、10μg/ml浓度的LPS作用RASMC 6、12、24、48h细胞活力均显著增强(P0.05);100μg/ml浓度的LPS作用6、12、24h细胞活力上升(P0.05),但作用48h细胞活力显著下降(P0.05)。0.5μg/ml浓度的LPS作用24h的促增殖能力最显著(P0.05)。2.化痰活血解毒方对LPS作用下RASMC增殖活性的影响:10%、20%、40%浓度的瑞舒伐他汀和高剂量化痰活血解毒方作用24、48h均能显著抑制LPS的促增殖作用(P0.05),二者之间无显著差异(P0.05);10%浓度的化痰活血解毒方低剂量组作用24h及20%、40%浓度的化痰活血解毒方低剂量组作用24、48h均可以抑制LPS的促增殖作用(P0.05),但显著弱于瑞舒伐他汀组、化痰活血解毒方高剂量组(P㩳0.05)。3.化痰活血解毒方对LPS诱导RASMC分泌炎症因子的干预作用:与空白组相比,LPS组TNF-α、IL-6、MCP-1、MMP-9水平及MMP-9/TIMP-1的比例显著升高、TIMP-1水平显著降低(P0.05)。与LPS组相比,瑞舒伐他汀组、化痰活血解毒方低剂量组、化痰活血解毒方高剂量组TNF-α、IL-6、MCP-1、MMP-9水平及MMP-9/TIMP-1的比例显著降低,TIMP-1水平显著升高(P0.05)。瑞舒伐他汀组、化痰活血解毒方低剂量组间TNF-α水平无显著差异(P0.05),瑞舒伐他汀组、化痰活血解毒方低剂量组TNF-α水平显著高于化痰活血解毒方高剂量组(P0.05);瑞舒伐他汀组、化痰活血解毒方低剂量组、化痰活血解毒方高剂量组三者之间IL-6水平无显著差异(P0.05);化痰活血解毒方高剂量组MCP-1水平显著低于化痰活血解毒方低剂量组(P0.05),瑞舒伐他汀组MCP-1水平显著低于化痰活血解毒方低剂量组、化痰活血解毒方高剂量组(P0.05);瑞舒伐他汀组、化痰活血解毒方低剂量组间MMP-9水平无显著差异(P0.05),化痰活血解毒方高剂量组MMP-9水平显著低于瑞舒伐他汀组(P0.05),化痰活血解毒方低剂量组、化痰活血解毒方高剂量组间MMP-9水平无显著差异(P0.05);瑞舒伐他汀组TIMP-1水平显著高于化痰活血解毒方低剂量组、化痰活血解毒方高剂量组(P0.05),化痰活血解毒方高剂量组TIMP-1表达水平显著低于化痰活血解毒方低剂量组(P0.05);瑞舒伐他汀组、化痰活血解毒方低剂量组、化痰活血解毒方高剂量组之间MMP-9/TIMP-1的比例无显著差异(P0.05)。4.化痰活血解毒方对LPS作用下RASMC凋亡的影响:与空白组比较,LPS组RASMC凋亡率显著降低(P0.05);与LPS组比较,瑞舒伐他汀组、化痰活血解毒方低剂量组、化痰活血解毒方高剂量组的凋亡率显著升高(P0.05);瑞舒伐他汀组、化痰活血解毒方高剂量组间的凋亡率无显著差异(P0.05),瑞舒伐他汀组、化痰活血解毒方高剂量组间的凋亡率显著高于化痰活血解毒方低剂量组(P0.05)。5.化痰活血解毒方对LPS诱导下RASMC迁移能力的影响:与空白组比较,LPS组的RASMC迁移能力显著提高(P0.05);与LPS组比较,瑞舒伐他汀组、化痰活血解毒方低剂量组、化痰活血解毒方高剂量组RASMC的迁移能力均显著降低(P0.05);瑞舒伐他汀组与化痰活血解毒方高剂量组间的迁移能力无显著差异(P0.05),瑞舒伐他汀组与化痰活血解毒方高剂量组的迁移能力显著高于化痰活血解毒方低剂量组(P0.05)。6.化痰活血解毒方对RASMC表型转化的影响:与空白组比较,LPS组α-SM-actin mRNA和蛋白的表达减少(P0.05),OPNmRNA和蛋白表达升高(P0.05);与LPS组比较,瑞舒伐他汀组、化痰活血解毒方低剂量组、化痰活血解毒方高剂量组α-SM-actin mRNA和蛋白的表达升高(P0.05)和OPNmRNA和蛋白表达减少(P0.05);瑞舒伐他汀组、化痰活血解毒方高剂量组抑制RASMC表型变化无显著差异(P0.05),化痰活血解毒方低剂量组抑制RASMC表型变化弱于瑞舒伐他汀组与化痰活血解毒方高剂量组(P0.05)。7.化痰活血解毒方对LPS诱导RASMC中ERk、p38MAPK、JNKmRNA及p-ERK1/2、p-p38MAPK、p-JNK蛋白表达的影响:与空白组比较,LPS组E RK1/2、JNK、p38MAPKmRNA及p-ERK1/2、p-p38MAPK、p-JNK蛋白的表达水平显著升高(P0.05);与LPS组比较,瑞舒伐他汀组、化痰活血解毒方低剂量组、化痰活血解毒方高剂量组ERK1/2、JNK、p-38MAPKmRNA及p-ERK1/2、p-p38MAPK、p-JNK蛋白的表达水平显著降低(P0.05);瑞舒伐他汀组与化痰活血解毒方高剂量组之间ERK、JNK、p38MAPKmRNA及p-ERK1/2、p-JNK蛋白的表达水平无显著差异(P0.05),化痰活血解毒方低剂量组ERK、JNK、p38MAPKmRNA及p-ERK1/2、p-JNK蛋白的表达水平显著高于瑞舒伐他汀组、化痰活血解毒方高剂量组(P0.05);化痰活血解毒方高剂量组p-p38MAPK蛋白的表达水平显著低于瑞舒伐他汀组、化痰活血解毒方低剂量组(P0.05),化痰活血解毒方低剂量组p-p38MAPK蛋白水平显著高于瑞舒伐他汀组(P0.05)。8.化痰活血解毒方对LPS诱导的RASMC Bax、caspase-3、Bcl-2mRNA和蛋白的表达的影响:与空白组比较,LPS组促凋亡蛋白Bax、caspase-3mRNA和蛋白的表达降低(P0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2mRNA和蛋白表达升高;与LPS组比较,瑞舒伐他汀组、化痰活血解毒方低剂量组、化痰活血解毒方高剂量组组促凋亡蛋白bax、caspase3mRNA和蛋白的表达水平升高(P0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2mRNA和蛋白表达降低(P0.05)。结论:1.LPS可明显促进RASMC的增殖、迁移、表型转化并可诱导RASMC分泌TNF-α、IL-6、MCP-1、MMP-9及降低TIMP-1的表达。2.化痰活血解毒方可显著降低LPS诱导的RASMC分泌炎症因子的水平及上调TIMP-1的表达,诱导RASMC凋亡、抑制RASMC的增殖、迁移及表型转化。3.化痰活血解毒方干预炎症反应,抑制RASMC的增殖、迁移和表型转化可能与抑制MAPKs信号通路有关。4.化痰活血解毒方可以显著促进LPS诱导的RASMC凋亡可能是通过抑制ERK信号通路,下调Bcl-2、上调Bax、caspase-3蛋白表达实现的。
【图文】：
血清、⑤LPS+化痰活血解毒方高剂量组：RASMC+0.5μg/ml LPS+40%高剂量化痰活血解毒方含药血清图1 技术路线图2.6 MTT 法检测 LPS 对 RASMC 增殖的影响及化痰活血解毒方的干预作用2.6.1 细胞分组（1）LPS 的浓度、时间梯度组：①对照组：RASMC+10%FBS 培养基、②LPS 刺激组：RASMC+10%FBS 培养基+不同浓度 LPS(0.1μg/ml、0.01μ g/ ml、 0.5μ g/ ml、 1μ g/ ml、 10μ g/ ml、 100μ g/ ml），各组的 LPS作用时间分别为6h、12h、24h、48h。（2）含药血清干预组：0.5μg/ml LPS 诱导 RASMC 24h 后分别加入5%、 10%、 20%、 40%浓度的空白血清、瑞舒伐他汀含药血清、低剂量化痰活血解毒方含药血清、高剂量化痰活血解毒方含药血清，分别干预24h、48h。
图 2 LPS 对 RASMC 活力的影响0μg/ml 浓度的 LPS 比较，aP＜0.05；与 0.5μg/ml 浓度bP＜0.05活血解毒方对 LPS 促 RASMC 增殖的干预作用μ g/ ml 浓度的 LPS 诱导 RASMC 24h 后加入 5%、10%、20空白血清、瑞舒伐他汀血清、化痰活血解毒方血清作用24果显示：与空白组比较，LPS 作用24、48h 均可促进 RAS0.05）。与 LPS 组相比，5%浓度的含药血清均不能抑制 的增殖作用（ P＞ 0.05），，而 10%浓度的瑞舒伐他汀和高剂毒方均能抑制 LPS 对 RASMC 的增殖作用（P＜0.05），二差异（P＞0.05）。与 LPS 组比较，10%浓度的化痰活血解干预24h 能抑制 LPS 对 RASMC 的增殖，差异有统计学意但弱于瑞舒伐他汀组、化痰活血解毒方高剂量组（ P㩳 0.
【学位授予单位】：河南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【参考文献】
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