异土木香内酯通过AMPK信号通路抗肝癌作用研究

发布时间：2020-05-07 14:48

【摘要】：肝癌是全世界最常见六大癌症,也是癌症中导致死亡的第二大原因,我国肝癌的发病率在世界水平上相对较高,对还在处于发展中的中国的医疗和社会保障产生了严重的经济负担。肝癌有着发现难,进展快的特点,目前还没有标志物能够准确检测出早期肝癌,通常患者确诊的时候已经到达晚期,错过了最佳手术治疗时机。目前治疗肝癌的靶向性药物的特异性都不高,并且针对单一靶点的靶向药物连续用药后容易产生耐药性,仍然需要找到针对更多靶点的药物增加肝癌治疗效果,延长患者的生存期,改善生活质量。AMPK是一种与能量代谢相关的蛋白,当细胞中ATP低于阈值后会激活AMPK,抑制ATP消耗,包括脂质、RNA和蛋白质的合成。肿瘤细胞是一种高增殖的细胞,会消耗大量的ATP用于合成各种物质,肿瘤组织中AMPK的表达会比肿瘤周围组织明显减低,提示AMPK是一种潜在的抗肿瘤靶点。中医中药是我国传统智慧的产物,有将近几千年的历史证明其有效性,现代医学研究发现中药的有效成分是一种重要的新药来源,最新发现异土木香内酯除了有抗菌杀虫作用以外,还有抗肿瘤作用。因此本研究目的在于探索异土木香内酯体内外抗肝癌作用,是否通过AMPK信号通路产生作用,并且初步探索相关机制。本课题研究内容分为三个部分。第一部分:异土木香内酯的体外抗肝癌作用采用MTT检测方法研究异土木香内酯的体外抗肝癌效果,明确了其抗肿瘤的剂量和时间依赖性,并求出其IC_(50)。异土木香内酯对Bel-7402 24 h、48 h和72 h的IC_(50)分别为37.4、25.46、22.36μM。HepG2则是34.82、26.32、20.22μM。第二部分:异土木香内酯的体内抗肝癌作用建立肝癌细胞Bel-7402的BALB/c荷瘤裸鼠模型。将异土木香内酯制备脂质体,每天灌胃给药1次,连续用药14天,隔天测量肿瘤体积和裸鼠重量,第15天处死动物后取肿瘤组织称重。90 mg·kg~(-1)异土木香内酯的体积抑制率有67.32%,重量抑制率有70.15%,并且其体内抗肿瘤作用具有一定的安全性。第三部分:异土木香内酯抗肿瘤机制研究利用Hoechst 33258观察异土木香内酯对肝癌细胞的形态改变。使用Annexin V-FITC、PI、DCFH-DA染色配合流式细胞仪检测细胞凋亡、周期抑制、ROS生成情况。结果显示40μM异土木香内酯能够诱导肝癌凋亡,将肝癌细胞增殖阻滞在G2/M期,同时可以显著升高ROS水平。使用Western bolt和免疫组化检测关键信号分子。结果发现,40μM异土木香内酯可以诱导p-AMPK、p53、Bax和Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase9的表达水平升高,同时可以抑制CyclinB1、CDK1和Bcl-2蛋白质表达水平的表达。免疫组化的结果显示,肿瘤组织中的p-AMPK、p53和Caspase3蛋白质表达也均会上调。综上所述,异土木香内酯在体内外均有抗肝癌作用。机制是通过产生ROS,激活AMPK通路,上调p53调控因子而诱导肝癌细胞凋亡,同时还能将肝癌细胞的生长周期阻滞于G2/M期,通过多靶点的方式抑制肝癌增殖。本研究将为异土木香内酯作为抗肝癌新药的研发和临床精准化使用奠定理论基础。
【图文】：

柱形图,抑制率,方差齐性检验,体外实验

X 轴为浓度，，Y 轴为抑制率作出柱形图，表上误差线。利用 GraphPad prism6.0的分析功能，把 X 轴换算成 LogX，根据三次的增殖抑制率分析算出三个孵育时间的 IC50。2.5.2 实验结果MTT 实验证明，IAL 对肝癌 Bel-7402 和 HepG2 均有明显的体外抑制作用，并且具有剂量依赖性和时间依赖性。经过 SPSS22.0 的 Levene 方差齐性检验，显示方差齐，F 检验显示各组之间有显著差异（p<0.01）；使用 LSD 统计两组之间差异，与空白组对比，大部分都有差异（见图 2-1）。把不同浓度不同时间段的抑制率输入 GraphPad prism6.0 计算，得出 IC50（见表 2-1）。在 24h 时间点上，20μM 以下浓度的 IAL 对于 HepG2 几乎没有抑制作用，浓度一旦到达 40μM 则抑制率增大至60%以上，可以认为 HepG2 细胞有某个耐药的阈值，而 IAL 对 Bel-7402 则没有这种现象，IC50也比 HepG2 高。根据 MTT 的结果，两种肝癌细胞在给药 48h 后，40μM和 80μM 已经超过 90%的抑制率，两组之间差异不大，故认为对于体外实验超过24 h 后 40 μM 即可使细胞进入大量死亡状态，高浓度药效差异消失。

趋势图,体重变化,趋势,体积数据

图 3-1 荷瘤裸鼠体重变化趋势（Mean SD，n=6）Fig.3-1 Weight changes of tumor-bearing nude mice（Mean SD，n=6）在实验进行期间，可以观察到裸鼠的皮下肿瘤随时间变大，触摸肿瘤位置固定，手感结实。根据隔天度量的体积数据，以实验天数为横坐标，肿瘤体积为纵坐标作点线图，标出误差线（见图 3-2）。统计每天的体重数据，经过 Levene 方差齐性检验，显示每天均方差齐。接着使用 F 检验，第三天开始各组间出现差异（p<0.05），第十一天开始有明显差异（p<0.01）。使用 LSD 在模型组与各组之间对比，直到第九天，5-FU 组和 IAL-H 组开始出出现差异（p<0.05），隔天差异明显（p<0.01）。IAL-M 组和 IAL-L 组也会出现差异，不过出现时间会相对推迟。在实验期间，脂质体对照组始终与模型组没有差异（p>0.05）。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

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