【摘要】：目的从PD-1/PD-L1信号通路出发,通过实验研究,采用H22肝癌细胞株传代培养移植法构建荷瘤小鼠模型,检测药物干预后荷瘤小鼠体内肿瘤的生长速度、荷瘤小鼠脾脏T淋巴细胞凋亡比例、荷瘤小鼠肿瘤周围浸润细胞PD-1表达阳性比例;以TGF-β1-si RNA抑制PD-1信号通路为对照,体外观察龟鹿二仙胶对小鼠T淋巴细胞株CTLL-2中PD-1的m RNA及蛋白表达水平的影响。探讨龟鹿二仙胶调节肿瘤细胞免疫的分子机制,分析其对顺铂引起的T细胞损伤是否有保护作用,为中医药辅助治疗恶性肿瘤提供科学依据。方法1构建模型及细胞悬液:采用H22肝癌细胞株传代培养移植法构建小鼠体内移植瘤模型,常规培养传代H22肝癌细胞株,接种SPF级BALB/c腹腔,6d后处死小鼠,无菌取腹水,用PBS稀释成肿瘤细胞悬液,离心收集细胞,皮下接种于腋下,构建小鼠皮下移植瘤动物模型;CTLL-2细胞用含10%胎牛血清,100U/ml的IL-2,1%双抗(青链霉素混合液)的RMPI-1640培养液,置于37℃,5%CO2的培养箱中进行培养。显微镜下观察细胞为悬浮细胞。2分组给药:2.1体内实验分组给药:将荷瘤小鼠随机分为顺铂组、龟鹿二仙胶高剂量组、龟鹿二仙胶中剂量组、龟鹿二仙胶低剂量组、生理盐水组,每组3只:(1)顺铂组(化疗对照组):腹腔注射顺铂,每只3mg/kg,灌胃生理盐水,每只0.3ml;(2)龟鹿二仙胶高剂量组:腹腔注射生理盐水,每只0.2ml,灌胃龟鹿二仙胶0.38g;(3)龟鹿二仙胶中剂量组:腹腔注射生理盐水,每只0.2ml,灌胃龟鹿二仙胶0.19g;(4)龟鹿二仙胶低剂量组:腹腔注射生理盐水,每只0.2ml,灌胃龟鹿二仙胶0.095g;(5)生理盐水组(阴性对照):腹腔注射生理盐水,每只0.2 ml,灌胃生理盐水,每只0.3 ml;(全部10天后开始给药治疗,连续给药9天)。2.2体外实验分组给药:在6孔细胞培养板中加入H22肝癌细胞,24h后每孔在加入5×106个CTLL-2细胞转染TGF-β1-si RNA后的CTLL-2悬液。分为龟鹿二仙胶组+TGF-β1-si RNA组、龟鹿二仙胶组、顺铂+TGF-β1-si RNA组、顺铂+龟鹿二仙胶+TGF-β1-si RNA组、顺铂+龟鹿二仙胶组、顺铂组、细胞对照+TGF-β1-si RNA组、空白对照组:(1)顺铂+龟鹿二仙胶组:用含10uM顺铂和6%龟鹿二仙胶大鼠血清(补4%胎牛血清)的培养基处理细胞;(2)顺铂+龟鹿二仙胶+TGF-β1-siRNA组:转染TGF-β1-siRNA,24h后用含10uM顺铂和6%龟鹿二仙胶大鼠血清(补4%胎牛血清)的培养基处理细胞;(3)顺铂组:用含10u M顺铂的培养基处理细胞;(4)顺铂+TGF-β1-siRNA组:转染TGF-β1-siRNA,24h后用含10uM顺铂的培养基处理细胞;(5)龟鹿二仙胶组:用含有6%龟鹿二仙胶大鼠血清(补4%胎牛血清)的培养基培养细胞;(6)龟鹿二仙胶+TGF-β1-siRNA组:转染TGF-β1-siRNA,24h后用含6%龟鹿二仙胶大鼠血清(补4%胎牛血清)的培养基处理细胞;(7)细胞对照+TGF-β1-siRNA组:转染TGF-β1-siRNA;(8)细胞对照组:只加完全培养基;37℃培养2d后进行相关检测。2.3检测指标2.3.1荷瘤小鼠瘤重检测:分别在给药后第1,4,7,10,13,16,19天用游标卡尺测量肿瘤大小。待瘤19天长大后将小鼠处死,拍照,取出瘤子进行称重、记录保存,同时取出脾脏立即分离淋巴细胞用于流式检测。2.3.2荷瘤小鼠脾脏T淋巴细胞凋亡比例检测:先收集荷瘤小鼠脾脏T淋巴细胞再行流式细胞仪检测T淋巴细胞凋亡及肿瘤浸润性T细胞PD-1+比例;2.3.3体外实验细胞PD-1 m RNA和蛋白表达检测:Real-Time PCR技术检测体外共培养体系中的CTLL-2细胞经实验药物干预后PD-1 m RNA的表达;Western Blot法检测PD-1的表达影响。3结果3.1 14天后与生理盐水对照组相比,顺铂组、龟鹿二仙胶高剂量组、龟鹿二仙胶中剂量组在均有明显抑制瘤体生长的作用(P0.05),且高剂量组的抑制瘤作用较低剂量组明显P0.05)。3.2龟鹿二仙胶高、中、低剂量组的早期T淋巴凋亡比明显低于顺铂组和生理盐水(阴性对照)组,差异有统计学意义(P0.05),其中龟鹿二仙胶中、高剂量组较低剂量组具有更明显的降低早期T淋巴细胞凋亡的作用(P0.05);而在龟鹿二仙胶中、高剂量组之间作用无明显差异(P0.05);龟鹿二仙胶高剂量组的晚期凋亡细胞比明显低于顺铂组及生理盐水(阴性对照)组,差异有统计学意义(P0.05)。3.3龟鹿二仙胶高剂量组、龟鹿二仙胶中剂量组的PD-1表达阳性细胞比明显低于与顺铂组和生理盐水组,差异有统计学意义(P0.05)。3.4与细胞对照组相比顺铂不影响CTLL-2细胞中PD-1阳性细胞比例(P0.05)但能够显著促进其凋亡(P0.05),龟鹿二仙胶能够显著抑制CTLL-2细胞凋亡降低PD-1阳性细胞比例(P0.05);龟鹿二仙胶+顺铂组较顺铂组相比细胞凋亡水平有所下降;龟鹿二仙胶和TGF-β1-si RNA均能降低T细胞PD-1 m RNA表达水平,且联合使用效果更明显,但其中是否具有协同作用尚不明确。3.5与细胞对照组比较,龟鹿二仙胶组、顺铂+龟鹿二仙胶组、顺铂+TGF-β1-si RNA组、龟鹿二仙胶+TGF-β1-si RNA组、细胞对照+TGF-β1-si RNA组PD-1表达水平均下调,差异有统计学意义(P0.05),顺铂组对PD-1的表达影响不明显;龟鹿二仙胶+TGF-β1-si RNA组的降低PD-1蛋白表达作用比细胞对照+TGF-β1-si RNA组更显著(P0.05)。顺铂能够引起CTLL-2的凋亡,而龟鹿二仙胶能够抑制顺铂诱导CTLL-2细胞凋亡的效应。4结论4.1龟鹿二仙胶可以通过抑制T细胞凋亡,降低肿瘤周围T淋巴细胞PD-1表达的比例,从而提高细胞免疫力,抑制肿瘤生长,改善荷瘤小鼠的免疫功能,达到抗肿瘤的目的;4.2龟鹿二仙胶不仅能够降低肿瘤细胞诱导的T细胞PD-1表达水平上调,同时还能够抑制顺铂诱导的CTLL-2细胞凋亡,从而减少化疗引起的免疫抑制,保护患者细胞免疫,有利于治疗肿瘤。
【图文】：
鹿二仙汤治疗乳腺恶性肿瘤患者，服药 5 天后白细胞升至正常水平者 41 例效 7 例，无效 2 例，总有效率 98%。师林等[27]将 75 例晚期 NSCLC 患为对照组（GP 化疗组）和治疗组（GP 化疗方案加龟鹿二仙胶汤组），经疗程的治疗后，治疗组 CD4+、CD4+/CD8+ 比值、NK 细胞活性治疗后均高于治疗前（P<0.05）；治疗组 G-CSF 使用率少于对照组（P<0.01）。我期的实验研究结果也表明[33]：龟鹿二仙胶能够抑制化疗小鼠脾脏 T 淋巴细凋亡，对肿瘤治疗后的免疫功能具有保护作用。但其内在机制目前尚不明确 小结在中医学“整体局部辨证统一”理论指导下，结合传统中医中药对机体免疫影理论基础，通过实验研究，探讨中药复方龟鹿二仙胶对恶性肿瘤生长及化疗疫功能抑制的下调作用，，揭示龟鹿二仙胶可能通过影响免疫功能从而达到抗的目的，为龟鹿二仙胶在恶性肿瘤治疗中的推广运用提供理论依据。
顺铂各剂量与肿瘤细胞抑制率之间的关系图
【学位授予单位】：浙江中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【参考文献】
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本文编号：
2653194
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