葛根炭提高黄芩苷溶解度、生物效应及其机制初探

发布时间：2020-05-07 15:53

【摘要】：目的:(1)以葛根炭为前驱体,制备出安全、绿色、经济的葛根炭纳米粒子。(2)研究葛根炭纳米粒子对黄芩苷溶解度和体内药动学的影响。(3)通过药效学实验研究葛根炭纳米粒子对黄芩苷抗炎、镇痛作用的影响。(4)初步探究葛根炭纳米粒子提高黄芩苷溶解度的机制。方法:(1)通过马弗炉高温闷煅法制备出葛根炭,并提取分离纯化出葛根炭纳米粒子。利用HPLC比较葛根溶液和纯化后的葛根炭溶液两者之间的成分差异,再运用透射电镜、紫外光谱、荧光光谱、X-射线衍射、X-射线光电子能谱、红外光谱、能量色散X射线光谱对葛根炭透析液进行形态结构、光学特征、分子结构以及表面元素组成等进行表征鉴定。(2)通过CCK-8法,检测不同浓度的葛根炭纳米粒子对RAW264.7细胞活性的影响。(3)葛根炭纳米粒子溶液中加入黄芩苷,混匀,离心,取上清液,再利用HPLC方法检测上清液中黄芩苷含量,并采用透射电镜、红外光谱、差示扫描量热、X-射线衍射和紫外光谱等方法对其进行表征鉴定;同时采用HPLC方法研究温度和pH值葛根炭纳米粒子和黄芩苷复合物的影响。(4)采用间接酶联免疫分析法检测葛根炭纳米粒子对黄芩苷在体内药代动力学的影响(5)利用二甲苯致小鼠耳肿胀和醋酸致小鼠扭体两种模型,研究葛根炭纳米粒子对黄芩苷抗炎镇痛作用的影响。(6)通过HPLC法分别测定溶解在葛根炭纳米粒子溶液中汉黄芩苷、野黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和野黄芩素的含量;再采用透射电镜、红外光谱、差示扫描量热、X-射线衍射和紫外光谱分析方法对汉黄芩苷和野黄芩苷分别和葛根炭纳米粒子形成的复合物进行表征鉴定,考察葛根炭纳米粒子对不同黄酮类化合物溶解度的影响。结果:(1)HPLC分析结果发现葛根中的小分子成分并没有在纯化的葛根炭溶液液中检测到,说明小分子化合物已经去除干净;从表征结果得知,从葛根炭水提液中纯化出了粒径平均直径为3.95±1.29nm、晶格间距为0.263nm、量子产率为7.0%的与碳点类似的一种新型纳米颗粒,将其命名为“葛根炭纳米粒子”。这种成分是近似球形,均匀分散且无定形的;主要由碳和氧元素组成且表面具有丰富的活性功能基团;在最大激发波长380nm处得到的最大发射波长为475nm的纳米颗粒。(2)CCK-8法测定葛根炭纳米粒子的安全剂量约265.00μg/mL。(3)黄芩苷在葛根炭纳米粒子溶液中,其浓度随着葛根炭纳米粒子浓度的增加而增加。表征结果发现纳米粒子与黄芩苷相互作用,形成复合物。此外,温度和pH值可以影响纳米粒子对黄芩苷溶解度的作用强弱。(4)建立icELISA方法测定小鼠血液中的黄芩苷含量,结果显示黄芩苷-葛根炭纳米粒子组的最大血药浓度(C_(max))是黄芩苷组的2倍,前者的药时曲线面积(AUC_(0-t))是后者的1.7倍。两组的平均滞留时间(MRT)相比较,黄芩苷+葛根炭纳米粒子组比黄芩苷组大。葛根炭纳米粒子不仅可以增加黄芩苷在体内的吸收率,也可以提高其在小鼠体内的生物利用度。(5)抗炎镇痛作用结果显示,与黄芩苷组相比,黄芩苷+葛根炭纳米粒子组具有显著性抗炎镇痛作用(P0.01),可以显著降低小鼠耳肿胀度,减少小鼠扭体次数。与模型组相比较,葛根炭纳米粒子存在抗炎镇痛作用(P0.05)。葛根炭纳米粒子可以显著提高黄芩苷的抗炎、镇痛作用。(6)葛根炭纳米粒子葛根炭纳米类粒子可以显著的增加黄酮苷类化合物黄芩苷、汉黄芩苷和野黄芩苷的溶解度,尤其是黄芩苷。但是,对黄酮苷元类化合物黄芩素、汉黄芩素和野黄芩苷溶解度的作用较差。葛根炭纳米粒子葛根炭纳米类粒子增加黄芩苷溶解度的机制,主要与黄芩苷上的葡萄糖醛酸结构有关,两者之间可以通过分子非共价相互作用连接,形成复合物,氢键是两者发生作用的主要作用力,从而改善药物的溶解性。结论:黄芩苷在水中极差的溶解性,导致其药物开发和临床应用受到诸多限制。本实验采用一种新型的纳米材料以及简单而有效的方法来增加黄芩苷的溶解度。通过高温闷煅法制备出绿色、经济的葛根炭纳米粒子,其低毒性,生物安全性高。利用体内体外实验证明,葛根炭纳米粒子可以显著增加黄芩苷溶解度和生物利用度,且还可以提高其抗炎镇痛作用。在此基础上,通过研究葛根炭对其他黄酮苷及苷元类化合物的溶解度的作用,初步的探讨了其增加黄芩苷溶解的机制主要是通过氢键作用,这就为黄芩苷的进一步开发提供了依据。
【图文】：

色谱图,黄芩苷,色谱图,黄芩

当RPC-NPs溶液浓度为530.00μg/mL、265.00μg/mL、132.50μg/mL时,黄芩素的浓度分别为27.6±0.79、26.1±0.09、20.80±0.41(μg/mL)。如图24B,24A所示,汉黄芩素和野黄芩素在RPC-NPs溶液中几乎不溶。从图24可以看出,苷类化合物BA、汉黄芩苷和野黄芩苷的溶解度随着在RPC-NPs浓度的增加而增加,尤其是黄芩苷。然而,苷元类化合物黄芩素、汉黄芩素和野黄芩素在RPC-NPs溶液中的溶解度较差。图2 3 野黄芩苷色谱图

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图2 2 汉黄芩苷色谱图图2 4 六种不同化合物在RPC-NPs溶液中的浓度分布:(A)黄芩苷和黄芩素;(B)汉黄芩苷和汉黄芩素;(C)野黄芩苷和野黄芩素
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284

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