高黄芩素对炎性骨溶解的作用机制研究

发布时间：2020-05-08 15:32

【摘要】：研究背景和目的:在骨质疏松、关节炎、佩吉特病、骨肿瘤、假体周围关节感染和假体周围松动等骨溶解疾病中,其共同特征为炎症诱导破骨细胞骨吸收功能增强。人体内,具有促进骨细胞形成功能的细胞有多种,但是具有有骨吸收功能的细胞只有破骨细胞。目前国际上用于防治炎性诱导的骨溶解的药物有几类,但是基于副作用的影响以及其疗效甚微,研发抑制炎症诱导骨溶解并且副作用较小、疗效更好的药物迫在眉睫。中国特色中草药单体属于天然活性产物,其中黄酮类中草药单体大部分都具有抗炎的作用,且具有副作用小、价格适宜等优点,成为抗炎性骨丢失药物治疗的热门。灯盏细辛的活性成分中属于黄酮类化合物的有高黄芩素,其生物功效包括抗炎抗肿瘤。在本文研究中,我们发现高黄芩素能在体外抑制破骨细胞形成和骨吸收功能以及抑制体内LPS诱导的炎性骨丢失作用。实验方法:(1)体外实验:1)取C57/BL6小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMMs),体外条件下在巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)的作用下测定高黄芩素对BMMs增殖的影响;选择对BMMs无毒副作用的浓度,检测高黄芩素对RANKL诱导BMMs向破骨细胞分化的作用,经抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAcP)染色,统计融合后大于或等于3个核的细胞数目,观测大小和数量的影响。2)探究高黄芩素对破骨细胞骨吸收功能的影响,应用羟基磷灰石涂片来模拟骨片,检测破骨细胞在涂片上的骨吸收功能。进一步探究影响骨吸收功能的机制,设计了F-actin ring染色实验,看是否对F-actin ring的形成有影响,从而影响了骨吸收功能。3)在BMMs向破骨细胞分化过程中,加以不同浓度的高黄芩素进行处理,利用实时定量PCR进行分析,看其对破骨细胞特异性基因的表达的影响。4)探索高黄芩素对破骨细胞形成和骨吸收功能影响的功能机制,利用蛋白免疫印迹(Western Blot)验证影响破骨细胞的分化以及骨吸收功能的相关信号通路,包括两大经典信号通路MAPK通路和NF-кB通路,检测高黄芩素对相关蛋白磷酸化的影响,从而判断高黄芩素是通过哪条信号通路发挥相应作用。(2)体内实验:脂多糖(LPS)诱导颅盖骨骨溶解模型,取7周龄C57/BL6雄鼠24只随机分为4组,空白对照组,LPS组,LPS+高黄芩素低剂量组,LPS+高黄芩素高剂量组,给予相应浓度的高黄芩素和LPS处理7天后收集小鼠颅盖骨,micro-CT和组织形态学分析实验结果。结果:(1)体外实验:1)高黄芩素可以抑制RANKL诱导的破骨细胞分化和形成;2)高黄芩素可以抑制破骨细胞的骨吸收功;3)高黄芩素可抑制破骨细胞分化过程中的特异性基因的表达;4)高黄芩素通过抑制NF-кB信号通路来影响破骨细胞分化和功能。(2)体内试验:高黄芩素减少LPS诱导的骨溶解模型小鼠的骨量丢失。结论:我们的研究表明,高黄芩素通过抑制NF-κB、c-Fos和NFATc1信号通路抑制RANKL诱导的破骨形成,是一种潜在的治疗溶骨性疾病的药物。
【图文】：

黄芩素,破骨细胞,黄素,骨吸收

高黄芩素对炎性骨溶解的作用机制研究硕士毕业论3.2 高黄芩素可抑制 F-actin 环的形成成熟的破骨细胞发挥其骨吸收功能，受到多种基因和蛋白的调控，在发挥这些功能的基础上，需要有完整 F-actin 环的参与，形成一个相对闭的封闭区域，以促进骨吸收的进展。所以我们设计相关实验探究高黄素是否对破骨细胞的 F-actin 环的形成有影响。通过图 5 我们可以发现，用 DAPI 染色发现细胞的整体数量未有明显差异，但是其 F-actin 环（红色的区别就很明显，高黄芩素高剂量组 F-actin 环就明显减少了。说明高黄素可抑制破骨细胞 F-actin 环的形成。

黄芩素,核转运

高黄芩素对炎性骨溶解的作用机制研究硕士色区域以外的地方，说明 p65 大部分处于细胞核外的位置。在看加处理组，，红色区域大部分被局限在蓝色区域，说明 p65 向核内转运是加了 RANKL 和高黄芩素组的状态和未加 RANKL、高黄芩素组的况较为一致，表明高黄芩素在BMMs 中可以抑制 RANKL 诱导的N的入核。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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